ASXL1缺失對人白血病HEL細胞生物學特性的影響

蔣 曉，肖方楠，劉怡寧，張明英，袁佳佳，邢 文，周 圓

(中國醫學科學院血液病醫院，中國醫學科學院血液學研究所，北京協和醫學院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，天津 300020)

典型的費城染色體(philadelphia chromosome，Ph)陰性骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPNs)是造血干細胞惡性克隆性增殖并伴隨成熟細胞增多的一類疾病，主要包括真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)和原發性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)[1-2]。研究發現，>95%的PV患者中都攜帶JAK2V617F的突變，且近60%的ET患者和50%的PMF患者也具有JAK2V617F突變。

JAK2是非受體蛋白酪氨酸激酶Janus激酶(JAKs)家族的成員，JAK活化可以促進細胞的增殖、分化、凋亡和遷移，并且通過參與轉錄激活因子(JAK/STAT)途徑，影響多種細胞生物學進程[3]，但是JAK2V617F突變在3種不同表型Ph陰性MPN發病機制中的作用尚未完全清楚[4-5]。此外，對MPN患者的高通量基因組分析發現，表觀遺傳調控因子如ASXL1、TET2、IDH、EZH2和DNMT3A等體細胞突變往往與JAK2突變共存[6]。其中，ASXL1在表觀遺傳調控中起著重要作用，目前幾乎在各種類型的髓系惡性腫瘤中都發現了ASXL1突變，例如骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic，MDS)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和MPN等，其在MDS、MPN和AML中的突變頻率分別約為20%、10%和20%[7-8]。臨床研究表明，與僅攜帶JAK2V617F突變的PV患者相比，攜帶ASXL1和JAK2V617F共突變的患者血紅蛋白(Hb)水平降低，白細胞(WBC)和血小板(PLT)計數增加，可觸及脾腫大，克隆性異常核型，其生存預后更差[9-11]。

已知ASXL1突變和JAK2V617F共存對MPN的發病有顯著影響，但ASXL1突變如何促進JAK2V617F突變導致的MPN疾病進展和預后不良尚不清楚。因此，本研究以攜帶JAK2V617F純合突變的人紅白血病細胞系HEL為模型，利用CRISPR-Cas9技術建立了HEL-AKO細胞系，為在細胞水平上闡明ASXL1功能缺失性突變與JAK2V617F協調參與MPN進展的作用機制提供了重要工具。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器HEL是JAK2V617F突變陽性的人紅白血病細胞系，購自ATCC細胞庫，由本實驗室保存。培養條件為含10% FBS的RPMI1640。

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自以色列Biological Industries公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)購自索萊寶公司；Cell Counting Kit-8購自日本Dojindo Laboratories公司；蘆可替尼購自MCE；CFC半固體培養(MethoCult H4230)購自StemCell Technologies公司；流式細胞儀Canto II購自美國Becton Dickinson公司；常溫臺式離心機購自德國Eppendorf公司。

1.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術建立ASXL1敲除的HEL細胞系

1.2.1病毒包裝 靶向人ASXL1基因的guide RNA序列為5′-CAGATTCTGCAGGTCATA-3′，包裝載體 psPAX2、pCMV-VSV-G以及目的質粒配制混合液，配制方法如下表所示，將混合液緩慢逐滴加入鋪好的293T細胞(1×107cells)，收集24和48 h病毒上清，超離濃縮，進行滴度測定后即可對HEL細胞進行感染，調整細胞密度為1×108L-1，根據病毒滴度，用含有Polybrene(終濃度5 mg·L-1)的培養基配制病毒混合懸液，進行一次感染，8 h后撤Polybrene，更換為新鮮培養基，過夜培養后進行二次培養。

1.2.2HEL細胞分選、測序 將經過二次病毒感染后的細胞擴大培養3 d。配制含嘌呤霉素(終濃度4 mg·L-1)的培養基，繼續用含嘌呤霉素的培養基篩5-7 d。將篩選完的HEL細胞的進行單細胞分選，放置1周左右，等克隆長大，即可轉出，根據每板克隆的生長情況，挑選相對較大的單細胞克隆轉出，擴大培養，提取DNA，測序，根據測序結果，即可挑出目的克隆。

1.2.3細胞STR檢驗 取適量檢材用Microread Genomic DNA Kit 提取DNA，采用MicroreaderTM21 ID System擴增20個STR位點和性別鑒定位點，使用ABI 3730xl型遺傳分析儀進行PCR產物檢測，使用GeneMapperID-X 軟件(Applied Biosystems)對檢測結果進行分析，并與ATCC和DSMZ數據庫進行比對。

1.3ASXL1敲除對HEL細胞增殖能力的影響根據Life technologies Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit操作說明書進行實驗。分別取出1×106生長狀態良好的HEL Control及HEL-AKO細胞系，細胞數根據細胞的增殖速度和檢測的間隔時間決定。每1 mL細胞液(1×106)加入1 μL 5 mmol·L-1染色液進行染色。剩余細胞37 ℃培養箱繼續培養，培養過程中不同時間點取出細胞并用4% PFA固定，待所有時間點取完后一同進行流式檢測。

1.4 HEL-AKO細胞的體外遷移實驗采用24孔板的Transwell小室(8 μm微孔)，取1×105生長狀態良好的HEL Control以及HEL-AKO細胞，加入到100 μL無血清培養基的上層Transwell小室中，在下室加入900 μL完全培養基，孵育24 h后，用4% PFA固定小室下表面上已經遷移過去的細胞后用0.1%結晶紫染色，在顯微鏡低下統計5個隨機視野中遷移過去的細胞。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期收集提前處理24 h的HEL Control以及HEL-AKO細胞系，參考碧云天BeyoClickTMEdU-647細胞增殖檢測試劑盒說明書進行實驗，處理完細胞后用流式細胞儀進行檢測。

1.6ASXL1敲除對HEL細胞克隆形成能力的影響分別收集HEL Control以及HEL-AKO細胞，制備成10×細胞懸液，分別取100 μL加至1.2 mL H4230甲基纖維素中，使最終每孔細胞數為300個，用注射器將混勻的細胞加入24孔板中，3個重復孔。14 d后計數CFC數目，并用0.05%甲紫染色，掃描儀掃描。

1.7 HEL-AKO細胞對蘆可替尼藥物敏感性檢測采用CCK-8法測定蘆可替尼處理72 h后對細胞的半數抑制濃度IC50(half maximal inhibitory concentration)。取對數生長期的HEL和HEL-AKO細胞，用含有20%血清的培養基調整細胞濃度為8×107個·L-1，接種于96孔培養板中，每孔90 μL；處理組加不同濃度的藥物，陰性對照組加等體積的藥物溶劑，使每孔終體積為100 μL。培養72 h后，加入CCK-8在酶標儀上檢測450 nm光密度(OD)值，并計算生長的抑制率。在GraphPad Prism7.0軟件中，以同一藥物的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖可得到劑量反應曲線，求出該藥物的半數抑制濃度IC50，即細胞存活率減少50% 時的藥物劑量。采用克隆形成法檢測蘆可替尼處理24 h后，HEL Control和HEL-AKO細胞在14 d后耐藥克隆的形成情況，具體方法參照“1.6”。

2 結果

2.1ASXL1敲除細胞的構建與鑒定選擇生長狀態良好的HEL細胞，分別感染攜帶pRSC-sgControl和pRSC-sgASXL1質粒的慢病毒。單克隆測序結果證明，HEL Control的DNA序列未發生任何變化，HEL-AKO的DNA序列發生13個堿基的缺失(GGTCATAGAGGCA)，第36個氨基酸發生移碼突變，編碼出38個氨基酸(Glu36TrpfsX38)(Fig 1A)。考慮到CRISPR/Cas9基因編輯技術可能存在脫靶，我們利用https://ccg.epfl.ch//tagger/tagscan.html網站檢測one mismatch和two mismatch可能脫靶基因，并挑選位于編碼區的基因，設計引物，在HEL-AKO細胞中進行測序驗證，均未發現脫靶(Fig 1B)，本文中僅列舉出one mismatch測序結果。細胞STR結果檢測HEL細胞DNA擴增后圖譜清晰，分型結果良好，細胞中沒有發現其它細胞交叉污染，與ATCC中HEL 92.1.7 ErythroleukemiaHuman細胞的STR數據匹配率為83%。該細胞的STR位點和Amelogenin位點的基因分型圖譜見附圖(Fig 1C)。

2.2ASXL1基因敲除對HEL細胞系的增殖能力和細胞周期的影響為了探究ASXL1敲除之后是否會對HEL的增殖能力產生影響，我們利用CFSE實驗以及克隆形成能力檢測了其增殖能力，比較發現HEL-AKO細胞的增殖能力變慢(Fig 2A、B)。為進一步了解ASXL1缺失對細胞周期的影響，我們使用流式細胞儀進行細胞周期檢測，結果顯示ASXL1敲除之后其細胞周期的G2/M期占整個細胞周期的比例增加，G0/G1期和S期均不受影響(Fig 2C)，此結果表明ASXL1可能是通過影響細胞周期的G2/M期來調控細胞生長。

Fig 1 HEL-AKO cell line established by CRISPR/Cas9 technology

2.3 檢測ASXL1敲除對HEL細胞克隆形成能力和遷移能力的影響為進一步了解ASXL1敲除后對HEL細胞克隆形成能力的影響，我們隨后又進行了半固體克隆形成能力實驗，結果表明，ASXL1敲除之后，與對照組相比，HEL-AKO細胞的克隆形成變小且克隆數降低(Fig 3A、B)。如Fig 3C所示，HEL-AKO細胞的遷移能力與對照組相比明顯增強。

2.4 HEL-AKO細胞經蘆可替尼處理后耐藥克隆增加蘆可替尼作為唯一治療中期或高風險骨髓纖維化的JAK2選擇性抑制劑，具有明顯的臨床活性，因此我們又測定了蘆可替尼對HEL-AKO細胞的半數抑制濃度(IC50)。結果表明，液體培養72 h條件下蘆可替尼對HEL和HEL-AKO的半數致死劑量分別是2.058 μmol·L-1和2.13 μmol·L-1(Fig 4A)，為了進一步考察藥物處理后對細胞的長期影響，我們利用克隆形成實驗來檢測ASXL1敲除后HEL細胞的耐藥克隆形成能力。選取對對照組細胞殺傷性較低的藥物劑量處理細胞24 h(2 μmol·L-1Ruxolitinib)，用PBS洗去殘余藥物后重新計數活細胞數，以相同體積細胞接種到0.4 mL H4230半固體培養基中，生長14 d后觀察形成的耐藥克隆的數目(Fig 4B)。其結果顯示，藥物處理后過表達HEL-AKO細胞形成的耐藥克隆數目明顯高于對照組，這說明藥物處理后ASXL1缺失的白血病細胞對蘆可替尼仍然具有較強的克隆形成能力。

Fig 2 Effects of ASXL1 knockout on proliferation and cell cycle of HEL cell lines n=2)

Fig 3 Clone formation ability of HEL-AKO cells n=2)

Fig 4 Effects of ruxolitinib on cloning formation ability of HEL-AKO cells n=2)

3 討論

ASXL1突變為JAK1V617F突變陽性MPN中最常見的共突變基因之一，且共突變患者發生骨髓纖維化比例更高，疾病進展更快，且與疾病進展及不良預后相關，但ASXL1與JAK2V617F協同作用參與MPN的內在機制尚無報道，本研究基于這一背景，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功建立了ASXL1基因敲除的HEL細胞系(HEL-AKO)。

在本研究中，我們發現ASXL1缺失后的HEL細胞的遷移能力變強，增殖能力變慢，細胞周期G2/M期進程延長，克隆形成能力減弱，在耐藥實驗中，HEL-AKO細胞對蘆可替尼表現出更強的耐藥性。蘆可替尼作為一種JAK1和JAK2抑制劑，是MPN治療中所應用的重要靶向藥物，可以通過減少脾臟大小，改善骨髓纖維化的相關癥狀，并提高MPN患者總體生存期[12-13]。本研究發現，ASXL1缺失與JAK2V617F共存時的HEL細胞較單獨JAK2V617F突變的細胞產生了明顯的蘆可替尼耐藥性。ASXL1作為重要的表觀遺傳因子，主要通過影響組蛋白修飾水平發揮作用，例如H3K27me3和H3K4me3等。另外，研究表明，JAK2除了激活JAK-STAT等信號通路，其自身也參與表觀遺傳調節，直接影響組蛋白的轉錄后修飾，從而參與染色質修飾過程，造成原癌基因例如HOX基因上調[14-15]，而這些HOX基因也大多正是ASXL1敲除后表達上調的基因，這提示我們ASXL1突變很有可能與JAK2V617F協同影響組蛋白修飾，影響特定的基因表達，進而影響了對蘆可替尼的耐藥性。此外，ASXL1被國際預后評分系統認為是PMF預后相關的獨立不良預后因素[16]，是否ASXL1缺失導致蘆可替尼耐藥也是其影響預后的重要原因。關于ASXL1缺失引起的耐藥也可能涉及其他多種機制，有研究表明白血病細胞的多藥耐藥機制與自噬水平密切相關，也可作為重要的切入點之一[17]。

由此可見，ASXL1的缺失對HEL-AKO細胞的生物學特性具有非常重要的影響，下一步我們將利用本細胞模型，結合小鼠模型及患者原代標本，深入闡明ASXL1與JAK2V617F突變協同參與MPN的分子機制，尋找新的藥物靶點和藥物治療組合，為臨床實踐提供進一步的實驗依據。