玻璃體腔內注射抗VEGF藥物治療DME對黃斑區微循環的短期影響

邱 煦，竇宏亮，陳鳳華

0引言

糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)是糖尿病視網膜病變(diabeticretinopathy,DR)損害視力的主要原因，近年廣泛采用的玻璃體腔內注射抗血管內皮生長因子(anti-vascular endothelial growth factor,anti-VEGF)方法，已成為治療DME等視網膜血管病變的一線治療[1-2]，并能明顯改善視力及促進黃斑結構的恢復[3]，但效果也受到一些因素的影響，如治療時機、黃斑結構損害程度等，其中黃斑區微循環是一個重要因素。黃斑區缺血越重，視力及結構損害就越重，預后及治療效果也越差，而抗VEGF治療是否能影響黃斑區的微循環，研究結果不一，有研究觀察到抗VEGF藥物可引起視網膜動脈血管收縮，血管直徑變小，甚至出現視網膜動脈阻塞，也有研究顯示治療后黃斑無血管區面積(foveal avascular zone，FAZ)擴大[4-7]，另外一些則未觀察到抗VEGF治療對黃斑區微循環的影響。多種因素可能導致結果的差異，其中就包括選擇的觀察指標和研究方法。目前在臨床上多采用黃斑區血管拱環的完整性及周長、FAZ面積的大小、有無非灌注等指標來反映黃斑區的微循環狀況，雖然用熒光素眼底血管造影(FFA)能做一些指標的定量分析，但受到的干擾因素比較多，并且不能反映黃斑區深淺層的血流變化[8]。本研究旨在運用OCTA定量分析抗VEGF治療DME時，FAZ、血管密度及形態的短期變化，探討OCTA在其治療隨訪中的臨床應用價值。

1對象和方法

1.1對象前瞻性分析2018-06/11于北京大學第三醫院眼科首次進行玻璃體腔注射融合蛋白類抗VEGF藥物治療的DME患者，共30例，其中男15例，女15例，僅單眼注藥的患者納入研究。入選標準：(1)2型糖尿病；(2)OCT測試出的黃斑區中心厚度(central foveal thickness,CFT)>250μm；(3)能獲得比較清楚的OCTA圖像。排除標準：(1)DME外其他任何引起視力下降的眼部疾病者，如脈絡膜新生血管、葡萄膜炎、眼內炎、未經控制的青光眼等；(2)在過去6mo內，接受視網膜激光或者其他眼科手術治療者；(3)眼壓>21mmHg者；(4)近視>-6.00D或遠視>3.00D；(5)其他需要住院治療的全身疾病者；(6)不能合作者。

所有患者首次并僅1次注射融合蛋白類抗VEGF藥物，在30d期間內準時完成4次OCTA檢查。眼內注射前，所有患者均行FFA、光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)和OCTA檢查。同時排除了OCTA圖像質量較差，包括Q-Score評分低于7，存在顯著的殘余運動偽影;黃斑區嚴重破壞的解剖特征(如嚴重黃斑囊樣水腫)導致分割錯誤的患眼4眼。最終26眼符合分析要求。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1治療方法注藥前獲得患者及家屬知情同意并簽字確認。注藥前3d滴5g/L左氧氟沙星眼液，4次/天。注藥方法：常規消毒鋪巾，4g/L鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉10min后，結膜囊內滴5g/L聚維酮碘浸泡90s后生理鹽水沖洗，于距角膜緣4mm睫狀體平坦部垂直進針注射抗VEGF融合蛋白，其中20眼注入康柏西普0.5mg/0.05mL，6眼注入阿柏西普2mg/0.05mL。以棉簽壓迫進針處，15min后測量眼壓，如無不良反應，結膜囊涂左氧氟沙星眼用凝膠并蓋無菌紗布，術后滴左氧氟沙星及醋酸潑尼松龍眼液3d。

1.2.2隨訪觀察常規檢查視力、眼壓、眼前節及眼底。并對患者進行最佳矯正視力(best-corrected visual acuity,BCVA)測試和CFT測量，BCVA檢查采用國際標準視力表測量，并轉換為最小分辨角對數(LogMAR)視力以便于統計分析。CFT以OCT(ZEISS Cirrus HD-OCT)測量的中心凹直徑為1mm的圓形區域內的CFT計算為平均值。

于注藥前、注藥后1、7d，1mo用AngioVue OCT掃描黃斑區，掃描前復方托吡卡胺散瞳。以黃斑小凹為中心掃描3mm×3mm區域,用機器自動軟件測量黃斑區淺層(從ILM到IPL以上10μm)和深層(從IPL以上10μm到OPL以下10μm)毛細血管密度、FAZ及周長(ILM-OPL以下10μm)、AI值。如自動分界不準確，可以通過人工進行調整和修正，測量中心凹300μm寬度內的血管密度(FD-300)，見圖1、2。

圖1 黃斑區分層血管密度測量。

2結果

2.1一般資料入選30例DME患者，男、女各15例，有4眼因圖形質量不符合要求而賜除，其余26眼納入統計分析，年齡69.0±13.408歲，右眼12眼，左眼14眼。14例伴隨高血壓，無腦梗、肝、腎功能損害等合并癥。中度NPDR 2眼，重度NPDR 17眼，PDR 7眼。平均糖化血紅蛋白(9.2±3.6)%。

2.2注藥前后FAZ、FD-300、PERIM、AI、BCVA、CFT的變化情況注藥前后不同時間BCVA、CFT、FAZ比較，差異均有統計學意義(F=22.126，P<0.001；F=41.293，P<0.001；F=3.653，P=0.016)。而注藥前后不同時間FD-300、PERIM及AI比較，差異均無統計學意義(F=0.594，P=0.621；F=2.598，P=0.059；F=0.438，P=0.726)。與基線比較，治療后視力明顯提高，CFT下降，而FAZ也有增大，見表1。

圖2 糖尿病黃斑水腫FAZ面積、周長及FD-300測量(以隨訪模式對比)。

表1 注藥前后不同時間BCVA、CFT和OCTA測量值的變化

2.3注藥前后BCVA及CFT的變化以Bonferroni法分析BCVA、CFT在各時間點的差異，治療后第1、7、30d的BCVA與基線相比均有改善，但1、7d差異無統計學意義(P=1.000、0.051)，而30d時的BCVA較治療前及治療后第1d有顯著改善(均P<0.001)；治療后7d與治療后1、30d比較，差異有統計學意義(P=0.026、0.004)。治療后1、7、30d CFT明顯下降，與基線相比持續降低(均P<0.001)，治療后1、7、30d CFT兩兩比較，差異均有統計意義(P=0.026、<0.001、<0.001)。治療后30d視力改善最明顯，而黃斑水腫在治療后1d即開始明顯減輕(圖3)。

圖3 注藥前后BCVA及CFT的變化 A：BCVA；B：CFT。

2.4注藥前后FAZ面積的變化治療前后不同時間的FAZ比較，差異有統計學意義(F=3.653，P=0.016)。治療后1d FAZ明顯大于治療前，差異有統計學意義(P=0.015)，治療后7、30d FAZ與治療前差異均無統計學意義(P=0.084、0.224)；治療后1、7、30d FAZ兩兩比較，差異無統計學意義(均P=1.000)，見圖4。

圖4 注藥前后不同時間FAZ的變化。

2.5BCVA(LogMAR)與CFT及FAZ的相關性經Pearson相關分析發現，BCVA(LogMAR)與CFT、FAZ均呈正相關(r=0.200，P=0.042；r=0.273，P=0.005)，表明FAZ越大，CFT值越大，視力越差。

3討論

DME是DR引起視力損害的重要原因之一[9]。DME眼內液VEGF水平可高出無視網膜病變的糖尿病患者10倍之多[10-11]，VEGF是一種多功能細胞因子，可導致視網膜血管通透性改變，是黃斑水腫的關鍵因子。相應的抗VEGF治療在臨床上獲得了良好的效果，已成為治療DME的首選方法。阿柏西普和康柏西普均是重組融合蛋白類抗VEGF藥物，作用機制是競爭性地抑制VEGF與其同源受體VEGFR-1和VEGFR-2的結合，可抑制VEGF-A、VEGF-B和胎盤生長因子(PlGF)的促進血管通透性和新生血管生成等功能，具有多靶點功效[12]。而單克隆類抗VEGF藥物雷珠單抗和貝伐單抗，僅與VEGF-A結合，發揮單靶點作用[13]。

隨著抗VEGF藥物的廣泛應用，除關注主要的治療作用外，對視網膜其他方面的影響不能忽視。一些研究觀察到抗VEGF藥物可使視網膜動脈血管管徑變小，血管密度減少[4-7]。作為VEGF抑制劑，有可能影響了VEGF本身的一些其他生理功能，如血管舒張作用或增加纖溶酶原激活物的表達，進而導致動脈栓塞的形成。FFA一直是觀察DR視網膜血管及微循環的主要方式，但因有創檢查，熒光素的過敏反應，不能清楚顯示微血管和深淺層毛細血管的變化，難以進行定量分析，具有一定局限性。所以臨床研究也采用視網膜激光散斑法、視網膜血流分析儀、OCTA等多種方法觀察視網膜微循環變化[14-16]。

本研究針對首次玻璃體內注射抗VEGF藥物治療DME進行早期多次觀察分析。采用BCVA和CFT兩個值來檢測治療黃斑水腫的效果，以OCTA定量分析黃斑血管密度、形態及無血管區面積的短期改變，選用的指標是FAZ、PERIM、AI、FD-300。結果顯示，經過首次抗VEGF藥物治療后，患眼的CFT明顯下降，視力改善，證明抗VEGF治療有效。

黃斑中心凹只有視網膜色素上皮細胞和視錐細胞兩層細胞，當DR發生早期，視網膜初缺血時，黃斑區FAZ便更易發生變化[17]。本研究檢測到注射抗VEGF藥后第1d FAZ值增大，而術后第7、30d與術前基線相比無統計學差異，提示抗VEGF藥物在短期(術后1d)內可能引起黃斑區FAZ的明顯改變。這可能是抗VEGF藥物在短期內抑制了一氧化氮(NO)的產生。由于VEGF能增強一氧化氮合成酶(eNOS)的活性，促進NO的表達，抑制NO的擴張血管作用，所以，抗VEGF藥物可能通過降低NO合成的途徑，使得FAZ短暫增大。曾有部分研究在動物實驗研究中觀察到了類似的結果[18]：Liu等[18]把1μg VEGF注射到成年小鼠玻璃體腔后，發現視網膜血管明顯擴張，在24h后達到高峰，與NO的高表達密切相關。而48～96h后視網膜血管擴張出現波動，認為與這期間的血管內白細胞淤滯有關。與術前基線的FAZ相比，本研究中第7、30d的FAZ無統計學意義，考慮理由有兩個：(1)抗VEGF藥物的不同作用因素相關[19-20]?？筕EGF藥物注射后視網膜灌注改善的可能因素包括：1)減輕VEGF誘導的白細胞淤積，降低了毛細血管的阻塞程度[21]；2)視網膜結構的恢復[22]；3)抑制因VEGF-A引起的毛細血管內皮細胞肥大，緩解了進行性毛細血管腔狹窄[23-24]。這些因素都有可能緩解視網膜的缺血狀況，使得FAZ變化。尤其是視網膜結構的恢復可能影響黃斑中心凹無血管區體積變化，可能引起毛細血管移位。我們的研究中發現，在術后第1d，CFT即明顯降低，黃斑無血管區的體積改變與FAZ面積的關聯尚待進一步研究。(2)藥物半衰期的變化：康柏西普和阿柏西普兩種藥物在人眼玻璃體內半衰期尚不清楚，兔眼中康柏西普半衰期為4.2d，阿柏西普為4.8d，雷珠單抗為2.8d[25]，在我們的研究中，術后第7、30d FAZ與術前基線無明顯統計學差異，藥物半衰期是否影響了視網膜血流變化也有待進一步研究。所以，我們雖檢測到抗VEGF藥物短期內FAZ的擴大，但這種擴大的原因尚不能確定，需要進行進一步研究。

黃斑區是視覺最敏銳的區域。黃斑FAZ對維持精細視力至關重要。本研究中，FAZ對BCVA(LogMAR)關系為正相關，FAZ值越大，視力越差；而CFT與BCVA(LogMAR)同樣表現為正相關關系，這與既往研究結果相符。評估糖尿病患者視網膜缺血的一個敏感指標是FAZ面積的擴大，在DR早期就開始有FAZ的變化[17]。本研究發現，在FAZ值增大有統計學意義的術后第1d，視力的改善也并不明顯(P=1)。而在注藥后30d BCVA較基線及術后第1d BCVA才有統計學意義的提高，考慮術后第1d視力不佳與第1d FAZ面積短暫性擴大有關。

升級后的OCTA系統可應用更多參數定量描述黃斑微循環結構。除了FAZ，FD-300是衡量血管密度的另一個相關參數。因其測量不受FAZ直徑影響，有學者認為當黃斑灌注已出現損害時FD-300能比較準確地測量黃斑灌注狀況[23,26]，這是由于神經叢合并的測量方法，既能提高FAZ的清晰度，又能最大限度地減少圖像采集本身的影響[26]。Ghasami Falavarjani等[27]分析了DME和正常眼黃斑區OCTA圖像，發現所有DME和30%的正常眼存在視網膜分層識別錯誤。基于此我們選擇了測量全層血管密度的FD-300以獲得相對準確的數據，而非經手動分層的視網膜淺層毛細血管網(SCP)、視網膜深層毛細血管網(DCP)等指標。

本研究中，測量FAZ結構更細化的參數FD-300、PERIM、AI在注藥后各時間點均無明顯變化。可能的原因有：(1)樣本量太小；(2)觀察時間點的選擇不同：在注射抗VEGF藥物之后，黃斑水腫和分割錯誤引起的毛細血管移位，在治療后可能恢復，但不知DME消退后移位的血管何時恢復到原有的位置[17]，亦不清楚治療后微小血管再開放的時間點；(3)抗VEGF治療本身不影響血管密度[18]，以往部分研究與我們的研究結果相符[18,28-29]。

抗VEGF藥物治療DME，以OCTA測量視網膜黃斑血流變化的作用與作用時間在以往的研究中尚無定論[30-34]：其研究結果間的差異，除了與所用的藥物、入選的患者、治療方案、測量時間點、測量方法、觀察指標等不同有關外，也可能與抗VEGF藥物作用的不同因素有關。與既往研究相比，本研究特點在于早期多次觀察首劑抗VEGF治療后視網膜黃斑微循環的變化，在注藥后短期內多次觀察，避免了病程延長糖尿病進展對FAZ變化的干擾[17，32]。本研究不足之處：(1)樣本量小，難以分組。康柏西普和阿柏西普雖同為融合蛋白，但結構域上仍有區別。阿柏西普是競爭性地抑制VEGF與其同源受體VEGFR-1和VEGFR-2的結合，而康柏西普將VEGFR-2的第四個細胞外區域合并到Fab中。這個區域雖不直接參與配體結合，但可以促進受體二聚化。二聚化受體與VEGF的結合力是單體受體的100倍。由于康柏西普獨特的第4結構域，使其對VEGF的親和力是貝伐單抗的50倍，是雷珠單抗的30倍，除此之外，二者在玻璃體內的半衰期尚不清楚，半衰期不同是否對視網膜黃斑區血流影響不同有待進一步研究[32]。(2)觀察時間短，難以分析抗VEGF藥物對黃斑區微循環狀況的長期影響。(3)OCTA本身的缺陷，如黃斑水腫影響視網膜分層，淺層投影干擾等[23,26]。(4)為避免分層錯誤，選用了FD-300這一指標，而對視網膜黃斑毛細血管深、淺層血液循環灌注情況沒有進行分別探討。(5)僅分析了黃斑區3mm×3mm范圍的微循環變化，未能反映全視網膜血流狀態。其研究結果尚需要長期、大規模的臨床研究加以證實。OCTA所具有的定量、分層、無創等特點，加之不斷的技術和算法的改進，可為臨床定量分析視網膜血流提供更準確、可靠的方法。

OCTA能比較準確定量測定DME的黃斑微循環變化?？筕EGF藥物治療DME有效，1d內可能影響FAZ,但這種影響較為短暫，1wk后FAZ減少，并伴有視力提高?？筕EGF藥物對視網膜血流長期影響及機制有待進一步探索。