HMGA1在葡萄膜黑色素瘤中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響

明 媚，張 勁，羅 鋼，蔡麗英，梅 雪

0引言

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)作為成人眼部最為常見(jiàn)的起源于葡萄膜的惡性腫瘤，發(fā)病率高居眼部腫瘤的第二位，且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)[1]。盡管現(xiàn)有診療手段不斷進(jìn)步，但患者總體生存率依然較低，預(yù)后不佳[2]。研究發(fā)現(xiàn)，高增殖活性及易發(fā)生眼外轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致該腫瘤診療困難及死亡率高的主要原因，有超過(guò)90%的患者死于肝轉(zhuǎn)移[3]。高遷移率族蛋白A1(high mobility group A1，HMGA1)作為一種核蛋白，在細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、胚胎形成及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[4]，研究發(fā)現(xiàn)HMGA1蛋白在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[5]。亦有研究指出，HMGA1參與了腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲過(guò)程[6]，但其在UM中的作用鮮有報(bào)道。本研究分析UM組織中HMGA1蛋白表達(dá)，并觀察其與人UM細(xì)胞系M23增殖、遷移和侵襲的相關(guān)性，以期為UM的病理機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2014-02/2019-08在我院接受手術(shù)治療的UM患者53例53眼，其中男29例29眼，女24例24眼；年齡28～76(平均48.36±11.14)歲；眼別：左眼25例，右眼28例；發(fā)生部位：睫狀體18眼，脈絡(luò)膜35眼；病理學(xué)類型：上皮細(xì)胞型19眼，梭形細(xì)胞型25眼，混合型9眼；35眼出現(xiàn)鞏膜浸潤(rùn)。所有患者術(shù)前未行放化療治療，均行病理學(xué)檢查確診，于眼球摘除后，剝離腫瘤組織，甲醛固定，石蠟包埋保存。同期，留取因外傷摘除眼球的正常葡萄膜組織34例34眼，其中男20例，女14例，年齡26～77(平均48.07±10.92)歲；眼別：右眼19例，左眼15例。所有患者排除UM和其他腫瘤。兩組患者性別、年齡、眼別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均衡可比。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選對(duì)象均知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑和設(shè)備免疫組織化學(xué)試劑盒及試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人HMGA1多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，人UM細(xì)胞系M23購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，HMGA1干擾序列和陰性對(duì)照序列由上海美軒生物科技有限公司提供，HMGA1和內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，Trizol總RNA提取試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，CCK-8試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Transwell小室購(gòu)自上海夏夷實(shí)業(yè)有限公司，Matrige基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中HMGA1蛋白表達(dá)取組織石蠟標(biāo)本，按4μm厚度連續(xù)切片，脫臘、水化，浸入枸櫞酸鹽緩沖液行加熱處理，PBS沖洗3次，浸入3%過(guò)氧化氫溶液，PBS沖洗3次，將一抗兔抗人HMGA1多克隆抗體1∶400稀釋后加入，過(guò)夜孵育(4℃)，PBS沖洗3次，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)60min，PBS沖洗3次，經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、封片，顯微鏡下觀察，高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，根據(jù)染色情況和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行判定[7]：(1)染色情況：不染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；(2)陽(yáng)性細(xì)胞比例：≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，≥76% 4分；(3)將(1)和(2)評(píng)分相乘，≤3分為陰性(-)，>3分為陽(yáng)性(+)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和處理用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)24h，胰酶消化，傳代。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，HMGA1下調(diào)組轉(zhuǎn)染HMGA1干擾序列(5’-GAGTCAGAAAGAGCCCAGT-3’)；陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)；空白組不作處理。各組轉(zhuǎn)染后按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR術(shù)檢測(cè)HMGA1mRNA表達(dá)取細(xì)胞，加入裂解液，提取總RNA并檢測(cè)濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列：HMGA1：上游：5’-GCAGGAAAAGGATGGGACTG-3’，下游：5’-AGCAGGGCTTCCAGTCCCAG-3’；GAPDH：上游：5’-CTTCTTTTGCGTCGCCAGCCGA-3’，下游：5’-ACCAGGCGCCCAATACGACCAA-3’。反應(yīng)條件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，74℃ 30s，連續(xù)36個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算HMGA1 mRNA表達(dá)量。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取各組細(xì)胞，胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，接種于96孔板，5×104/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96h時(shí)，向各孔加入CCK-8液20μL，利用酶標(biāo)儀取450nm波長(zhǎng)下對(duì)各孔檢測(cè)，記錄吸光度值(OD)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每次設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.6Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取各組細(xì)胞，胰酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，密度為5×105/mL，取200μL加入Transwell小室上室，將含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入小室下室，繼續(xù)培養(yǎng)24h，將小室取出，PBS沖洗，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，將散落細(xì)胞拭去，鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[8]。

1.2.7Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力將Matrige基質(zhì)膠用培養(yǎng)液稀釋后，在Transwell小室上室內(nèi)進(jìn)行均勻平鋪，過(guò)夜風(fēng)干。其余步驟同1.2.5中Transwell實(shí)驗(yàn)操作步驟。

2結(jié)果

2.1UM和正常葡萄膜組織中HMGA1蛋白表達(dá)UM組織中HMGA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為77%(41/53)，高于正常葡萄膜組織中的29%(10/34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.630，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組織法檢測(cè)UM和正常葡萄膜組織中HMGA1蛋白表達(dá)(SP) A：正常葡萄膜組織中HMGA1蛋白呈低表達(dá)；B：UM組織中HMGA1蛋白呈高表達(dá)。

2.2UM患者腫瘤組織中HMGA1蛋白表達(dá)情況HMGA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在不同年齡、性別、眼別、發(fā)生部位、視盤(pán)受累、繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落、腫瘤高度和病理學(xué)類型患者中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與未發(fā)生鞏膜浸潤(rùn)、未累及睫狀體和未發(fā)生眼外生長(zhǎng)的患者相比，HMGA1蛋白在發(fā)生鞏膜浸潤(rùn)、累及睫狀體和發(fā)生眼外生長(zhǎng)的患者腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 UM患者腫瘤組織中HMGA1蛋白表達(dá)情況眼(%)

2.3各組細(xì)胞中HMGA1表達(dá)HMGA1下調(diào)組、陰性對(duì)照組和空白組細(xì)胞中HMGA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.08、0.98±0.07和1.01±0.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=193.400，P<0.001)，HMGA1 mRNA在陰性對(duì)照組和空白組細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.431)，HMGA1 mRNA在HMGA1下調(diào)組細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組細(xì)胞增殖能力與陰性對(duì)照組和空白組相比，HMGA1下調(diào)組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96h時(shí)吸光度OD值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度OD值比較

2.5各組細(xì)胞遷移能力各細(xì)胞遷移能力相比，陰性對(duì)照組和空白組遷移細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HMGA1下調(diào)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組和空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表3。

圖2 Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 A：HMGA1下調(diào)組；B：陰性對(duì)照組；C：空白組。

2.6各組細(xì)胞侵襲能力各組細(xì)胞侵襲能力相比，陰性對(duì)照組和空白組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HMGA1下調(diào)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組和空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3，表3。

圖3 Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力 A：HMGA1下調(diào)組；B：陰性對(duì)照組；C：空白組。

表3 各組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較個(gè))

3討論

UM作為眼內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，且惡性程度高、增殖力和侵襲力強(qiáng)，早期便可發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]，有研究指出，轉(zhuǎn)移特別是突破眼眶的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[10]。因此，積極尋找與UM轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感基因?qū)颊咴\療及改善預(yù)后具有重要意義。HMGA1定位于人染色體6q21，在胚胎期高表達(dá)，但在成人正常組織中普遍低表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控多條途徑而在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄及DNA復(fù)制修復(fù)中發(fā)揮重要作用[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1蛋白高表達(dá)于多種惡性腫瘤組織[12-13]。研究表明，HMGA1高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞增殖[4]，HMGA1參與調(diào)控腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移[11]，其可作為一種靶基因在細(xì)胞侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，UM組織中HMGA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于正常葡萄膜組織，說(shuō)明HMGA1蛋白在UM組織中呈高表達(dá)，可能與該腫瘤的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)HMGA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與鞏膜浸潤(rùn)、累及睫狀體和眼外生長(zhǎng)相關(guān)，表明HMGA1蛋白可能參與了UM侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

本研究利用基因干擾技術(shù)特異性沉默M23細(xì)胞中HMGA1表達(dá)，結(jié)果顯示，HMGA1 mRNA在HMGA1下調(diào)組細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白組，表明HMGA1下調(diào)組細(xì)胞中HMGA1 mRNA表達(dá)被成功抑制。有研究指出，miR-424可靶向調(diào)控HMGA1阻滯細(xì)胞周期G1期進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的增殖[15]。本研究結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白組相比，HMGA1下調(diào)組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96h時(shí)吸光度OD值降低，說(shuō)明下調(diào)HMGA1表達(dá)可有效抑制M23細(xì)胞增殖，提示HMGA1可能參與了細(xì)胞增殖過(guò)程。另有研究指出，HMGA1可加速子宮頸癌的遷移和侵襲[16]。本研究結(jié)果顯示，HMGA1下調(diào)組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯少于陰性對(duì)照組和空白組，說(shuō)明HMGA1可能參與了M23細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程，可能是調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲的重要基因之一，但具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，UM組織中HMGA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，且與腫瘤惡性進(jìn)展指標(biāo)有關(guān)，下調(diào)M23細(xì)胞中HMGA1表達(dá)可減少細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，有望為UM機(jī)制研究及臨床診療提供新的潛在靶基因。