SOX5在口腔鱗癌CAL27細胞增殖、遷移和侵襲中的作用研究

王亞娥 孫李春 陳鐳雨 曾妍 鄭軍

832000, 石河子大學醫學院第一附屬醫院口腔科，石河子大學醫學院新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室

性別決定區域Y盒蛋白5(SOX5)屬SOXD亞族的成員，研究發現SOX5的異常表達參與多種腫瘤的發生、發展，包括垂體瘤、膠質母細胞瘤、淋巴瘤、肝癌等[1]，且與腫瘤的生物學行為密切相關，對于腫瘤而言，腫瘤細胞的生物學行為對于腫瘤的發展發揮著不可或缺的作用。本研究通過干擾SOX5探討其對CAL27細胞增殖、遷移和侵襲的作用，為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的診治及預后提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及轉染

常規培養CAL27細胞，轉染時提前一天將細胞接種至六孔板，按Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國)說明書進行轉染，對照組轉染Si-NC,實驗組轉染Si-SOX5。轉染后收集細胞，進行后續研究。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

使用Trizol(Invitrogen,美國)提取細胞中總RNA。逆轉錄合成cDNA，QuantiNava SYBR Green RT-PCR Kit試劑盒(QIAGEN,德國)進行qRT-PCR。引物序列為：SOX5正向5' -AACAAGCACAGATCCCCATTG-3' 和反向5' -ACACCGTAAGTGCTCTGGATA-3'；GAPDH正向5' - GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' 和反向5' - ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3' 。

1.3 免疫印跡實驗(Western blot)

RIPA裂解緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)提取細胞中總蛋白，電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上。按所需分子量裁膜，封閉后分別與SOX5(博士德生物工程有限公司)和GAPDH抗體稀釋液4 ℃過夜孵育12 h左右，加入稀釋后酶標羊抗兔IgG和酶標羊抗小鼠IgG(DAKO，美國)常溫低速搖床孵育2 h。進行發光檢測。

1.4 平板克隆實驗

調整細胞密度加入6 孔板(5 000 個細胞/孔)，每組重復3 孔，繼續培養10～14 d，定期換液，出現肉眼可見的克隆時停止培養，冰甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min，沖洗晾干后拍照，細胞計數軟件計數克隆細胞數，以數目大于50 個的細胞克隆為有效克隆，計算克隆形成率(%)=細胞平均克隆數/接種細胞個數(5 000)×100%。……