移植腎早期急性排斥反應患者血清微小RNA-21水平變化及其臨床意義▲

覃曉虹 劉志昂 陸婷婷 楊 溢 董建輝

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二三醫院1 檢驗科，2 移植科，廣西南寧市 530021，電子郵箱：499432680@qq.com)

研究表明，器官移植后容易出現排斥反應，而這是影響移植物能否在受者體內存活及存活時間長短的最主要因素[1]。因此，移植排斥反應的早期診斷也越來越受到重視。微小RNA(microRNA，miRNA)為內源性非編碼RNA，其在免疫調節、胚胎發育、腫瘤發生和進展等方面發揮重要作用[2-3]。最近有研究顯示，血清miRNA-21表達水平與腎細胞的增殖及凋亡有關[4]。但目前關于腎移植術后患者血清miRNA-21水平與移植腎早期急性排斥反應的關系的研究較少。因此，本研究探討腎移植術后患者血清miRNA-21表達水平變化及其與早期急性排斥反應的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月至2020年3月我院收治的78例腎移植術后患者作為研究對象。納入標準：均為首次行同種異體腎移植術且供受者血型相配，淋巴細胞毒試驗呈陰性，群體反應性抗體<10%。排除標準：發生嚴重手術并發癥者、多器官聯合移植者、重癥感染者及其他類型腎病者。根據腎移植術后1個月內是否發生急性排斥反應，將其分為急性排斥組33例和非急性排斥組45例。急性排斥反應的診斷：通過移植腎穿刺病理檢查結果、影像學檢查結果、實驗室檢測指標及患者臨床癥狀等綜合分析做出判斷[5]。急性排斥組中男性19例、女性14例，年齡23～58(36.59±6.07)歲；非急性排斥組中男性27例、女性18例，年齡21～60(35.31±5.59)歲。兩組患者在性別、年齡差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫院倫理學委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集：分別于術前及術后1周采集兩組患者晨起空腹靜脈血5 mL， 2 500 r/min離心15 min分離血清，置于-80℃保存待檢。

1.2.2 檢測方法：(1)參照TRIzol試劑盒(Life Technologies公司，產品批號：181103)說明書操作提取血清總RNA后，檢測樣本中RNA濃度及純度。(2)參照反轉錄試劑盒(Life Technologies公司，產品批號：190224)說明書進行反轉錄，反應體系為20 μL，包括2 μL RNA樣品、1 μL引物、1 μL反轉錄酶、1 μL內參引物、0.5 μL RNase 抑制劑 、1 μL dNTP混合物(10 mmol/L)、4 μL 5×RT 緩沖液、9.5 μL不含RNase的 H2O 。反應條件為42℃ 30 s，92℃ 10 min，65℃ 30 s，32℃ 1 min，產物置于-20℃保存。(3)采用實時熒光定量PCR儀(廠家：Life Technologies公司，型號：7900HT)進行PCR擴增，反應體系為25 μL，包括2 μL稀釋的cDNA、12.5 μL SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μL引物、8.5 μL ddH2O 。反應條件：30℃ 5 min，42℃ 10 min，85℃ 30 s，45℃ 1 min，40個循環。miRNA-21及內參U6引物由上海生工生物工程公司合成。miRNA-21上游引物序列為5′-AGCAAGUCUGAGUACUGAUGCAGUGCAUCAUGUCACCGUUGCAU-3′，下游引物序列為5′-ACAAAUCGACUUGCAUCGCCUGU-3′；內參U6引物序列為5′-TCTCGCTCGCACGCAGA-3′(正向)，5′-TAACGCTCACAATTTGCGGT-3′(反向)；miRNA-21反轉錄引物序列為5′-CUCGUGAUUUACUGGCCCCUGCUCGAGAGAUGAGGAUAACUAGCACUGAGCCA-3′；內參U6反轉錄引物序列為5′-CTTGCGCGGAATAGCTTCTTCAT-3′。miRNA-21的相對表達水平= 2-ΔΔCt值(miRNA-21)- 2-ΔΔCt值(U6)[6]計算。

2 結 果

2.1 兩組患者手術前后血清miRNA-21相對表達水平的比較 兩組患者術前血清miRNA-21相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；術后1周，兩組患者的血清miRNA-21相對表達水平均高于術前，且急性排斥組血清miRNA-21相對表達水平高于非急性排斥組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者手術前后血清miRNA-21相對表達水平的比較(±s)

2.2 血清miRNA-21對移植腎早期急性排斥反應的預測價值 以術后血清miRNA-21相對表達水平作為檢驗變量，以移植腎是否出現急性排斥反應為狀態變量作ROC曲線。結果顯示，血清miRNA-21預測移植腎早期急性排斥反應的曲線下面積為0.715(95%CI：0.794，1.608；P=0.009)，約登指數為0.692，最佳臨界值為2.04，特異度為81.93%，靈敏度度為93.65%，見圖1。

圖1 血清miRNA-21預測移植腎早期急性排斥反應的ROC曲線

2.3 Kaplan-Meier生存分析 根據腎移植受者術后1周血清miRNA-21相對表達水平，將患者分為miRNA-21高表達組(>2.19)27例和miRNA-21低表達組(≤2.19)51例。miRNA-21高表達組腎移植術后30 d內無急性排斥反應生存率為48.15%，低于miRNA-21低表達組的72.55%(χ2=4.568，P=0.033)，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

腎移植是大多數終末期腎臟疾病患者的理想治療方式，但術后移植腎可能會發生排斥反應，包括急性排斥反應和慢性排斥反應，其中急性排斥反應可對移植腎的長期存活造成一定影響[7-8]。因此，臨床上應重視移植腎急性排斥反應的早期診斷，并給予及時、有效的治療，以延長移植腎的存活時間。miRNA是一類具有高時序性、保守性、組織特異性等特征的內源性非編碼RNA，既往研究顯示，miRNA-199a-9p、miRNA-663等與急性排斥反應的發生存在一定關系[9-10]。miRNA-21位于17q23.2染色體上，其在腫瘤、腎臟疾病、心血管疾病等中發揮重要作用[11]。有研究顯示，腎移植術后患者血清miRNA-21的表達水平與其腎功能密切相關[12]。因此，本研究探討腎移植術后患者血清miRNA-21的表達水平及其與移植腎早期急性排斥反應的相關性。

晉力等[13]研究發現，miRNA-1426p、miRNA-144-5p、miRNA-130a-3p在腎移植術后急性排斥反應患者血漿中呈高表達。王本剛等[14]的研究表明，miRNA-27a和長鏈非編碼RNA LRFN2-2基因與腎移植后排斥反應的發生有關。由以上研究可知，miRNA與腎移植術后急性排斥反應密切相關。本研究結果顯示，術后1周，兩組患者的血清miRNA-21相對表達水平均高于術前，且急性排斥組患者的血清miRNA-21相對表達水平高于非急性排斥組(均P<0.05)；進一步采用Kaplan-Meier進行生存分析，發現miRNA-21高表達組的腎移植術后30 d內無急性排斥反應生存率低于miRNA-21低表達組(均P<0.05)。以上結果提示在移植腎急性排斥反應早期血清miRNA-21表達上調，且腎移植術后患者血清miRNA-21的水平變化與移植腎早期的急性排斥反應密切相關。

劉小友等[15]研究發現，miRNA-663在腎移植急性排斥反應中發揮調控作用，可作為早期診斷移植腎急性排斥反應的評價指標。Iwasaki等[16]研究發現， miRNA-142-5p和miRNA-486-5p可作為腎移植排斥反應的早期診斷標記物，兩者聯合診斷的特異度和靈敏度均較高。本研究結果顯示，術后血清miRNA-21預測移植腎早期急性排斥反應的曲線下面積為0.715，最佳臨界值為2.04，特異度為81.93%，靈敏度度為93.65%，提示miRNA-21對預測移植腎早期急性排斥反應具有重要價值。Khalid 等[12]研究發現，miRNA-21的異常表達可能提示腎移植患者預后不良。因此，我們推測術后血清miRNA-21或可作為預測移植腎早期急性排斥反應的生物學標記物。

綜上所述，在移植腎急性排斥反應早期患者血清miRNA-21表達上調，其或可成為預測移植腎早期急性排斥反應的生物學標記物。由于本研究樣本量有限，研究結果存在一定局限性，今后會增加樣本量，深入探討miRNA-21在移植腎急性排斥反應中的作用機制。