腐乳白點控制生產工藝參數的研究

包峻州，佟碩秋，蒲 靜，孟淑真，宮沛文，楊瀟垚，吳擁軍*

（貴州大學 生命科學學院 山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室 山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴州 貴陽 550025）

腐乳是我國傳統發酵食品之一，不同的發酵方法、不同的地域生產出來的腐乳風味都有較大差異[1-3]。腐乳發酵過程中伴隨著復雜的物理化學變化和生物化學變化，理化性質及化學組成的變化直接影響其功能特性[4-5]。腐乳白坯的制作為物理化學變化，前發酵是培養菌系和積累酶系的過程，后發酵是酶系作用于腐乳毛坯的過程[6-7]。腐乳白點是指存在于腐乳表面的白色顆粒狀晶體，懸浮于腐乳湯汁中或沉淀于容器底部，從而影響腐乳產品的外觀品質，因腐乳白點為晶體，口感上呈砂石感，進而影響產品銷售[8-10]。在發酵豆制品生產過程中，尤其是發酵階段的后期及貨架期，白點數量隨著時間的延長而呈現增多的趨勢[11-12]。目前對腐乳白點的研究主要集中在檢測腐乳白點的化學成分及影響白點產生因素等方面。孫軍勇等[13]利用凝膠電泳及質譜鑒定證實腐乳白點的主要物質為酪氨酸及少量蛋白質。周熒等[14]對不同食鹽含量的腐乳游離氨基酸進行檢測，發現隨著食鹽含量的降低，游離氨基酸含量逐漸上升。代來鑫等[15]通過對腐乳結晶物組分來源進行分析，證明以大豆為主要原料的腐乳其有機質在微生物和酶的作用下逐漸降解產生大量的NH4+。黃永濤等[16]通過對腐乳結晶物進行分析，發現該結晶物的主要成分為磷酸銨鎂。李理等[17]通過分離腐乳后酵階段的微生物，得到大豆蛋白在這些微生物的作用下水解釋放大量的酪氨酸，從而導致腐乳產生白點。代來鑫等[18]通過分析對比不同發酵時間的腐乳樣品，發現隨著后酵時間的延長，青方腐乳鹵湯中的氨氮含量顯著增加。許家威等[19]通過對腐乳前酵坯體氨基酸態氮含量的檢測，發現前酵過程中毛霉的不斷生長繁衍，產生了大量蛋白酶等酶系物質，蛋白質不斷的降解，導致氨基酸態氮含量逐漸上升。朱洪康等[20]通過研究紹興腐乳發酵過程中蛋白質水解與酪氨酸含量變化的規律，發現腐乳中白點的形成是由蛋白質過度水解造成的；江景泉[21]利用微波加熱使酶鈍化甚至失去活性，可以實現減少腐乳白點的產生。盡管目前對白點的研究較多，但尚無根本的解決方案。

因此，本研究以白腐乳為研究材料，考察腐乳生產加工過程中發花溫度、相對濕度、發花時間、擺胚間距、毛霉接種量對腐乳白點及氨基酸態氮含量的影響。對所選的工藝條件設置不同參數進行單因素試驗與正交試驗，優化腐乳生產工藝，以期減少腐乳白點的產生，獲得外觀、口感優良的腐乳產品，從而為白腐乳生產提供一定幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

雅致放射性毛霉（Actinomucor elegans）CICC3118：中國菌種保藏中心；冰醋酸（分析純）：開封市百川匯寶香料有限公司。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：新光化學試劑廠；酚酞、甲酸（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；37%甲醛溶液（分析純）：重慶江川化工（集團）有限公司。

1.1.3 培養基

孟加拉紅培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養基：上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：上海錦昱科學儀器有限公司；DH6000Ⅱ恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；UB102i光學顯微鏡：重慶澳浦光電技術有限公司；PHS-3C酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；DGL-50B立式蒸汽高壓滅菌鍋：江蘇登冠器械有限公司；CSB-06Z超聲波霧化工業加濕器：上海仙緣環保設備工程有限公司；FA2004N分析天平：杭州萬特衡器有限公司；FSM-225型分離式磨漿機：沈陽第三機械制造有限公司；Biochrom30＋全自動氨基酸分析儀：大昌華嘉科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腐乳制作工藝流程及操作要點[22]

選豆→泡豆→磨豆→煮漿→篩漿→冷卻→點漿→養花→蹲腦→壓榨→劃坯→擺坯→接種→培菌→涼花→搓毛→腌制→裹料→后酵→腐乳

操作要點：

精選東北非轉基因大豆按照料液比1∶3.5（g∶mL）加水浸泡，按大豆質量4‰添加食用堿，水溫22 ℃浸泡12 h，泡豆前pH 10～12，泡豆后pH（7.0±0.1）。濕豆與水按照料液比1∶2.3（g∶mL）進行磨漿，將豆漿濃度調整為9.5°Bé，煮漿30 min，然后悶漿10 min，經過濾網過濾去除豆渣，按照豆漿體積0.96‰加入冰醋酸點漿，82～83 ℃保溫養花15 min，80 ℃保溫蹲腦15 min，豆腐凝聚后去除黃漿水，將適量豆腐盛于壓榨機上壓榨23 min，對壓榨后豆腐進行分割得到白坯，按白坯間距2.0 cm進行擺坯，利用400倍光學顯微鏡下單視野孢子數4～5個的孢子懸浮液進行噴菌。毛霉生長階段俗稱發花，在發花溫度28 ℃，發花濕度88%條件下發花38 h，涼花1 h散去霉味，21%飽和食鹽水進行腌制14 h，加入4%的60%vol高粱酒，各種香料混勻后裝瓶，常溫下后酵3個月，即得白腐乳成品。

1.3.2 腐乳白點定性檢測

溶解性[23]：取腐乳表面的白點，置于清水、沸水、0.01mol/L鹽酸溶液、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液、甲酸溶液中，觀察其溶解情況。

燃燒性[23]：挑取腐乳白點置于酒精燈火焰上燃燒，觀察其燃燒情況。

氨基酸定性檢測[24]：挑取腐乳白點置于2%茚三酮溶液（pH 6），加熱觀察顯色情況。

1.3.3 發花工藝參數優化單因素試驗

發花溫度31 ℃，發花相對濕度80%，孢子懸浮液400倍光學顯微鏡單視野下孢子數為（14±1）個，發花時間42 h條件下，豆腐擺坯間距設置0.5cm、1.0cm、1.5cm、2.0cm四個梯度；

豆腐擺坯間距2.0 cm，發花溫度31 ℃，發花相對濕度80%，發花時間42 h條件下，毛霉接種量（孢子懸浮液400倍光學顯微鏡單視野下孢子數）設置（5±1）個、（8±1）個、（11±1）個、（14±1）個四個梯度；

豆腐擺坯間距2.0 cm，孢子懸浮液400倍光學顯微鏡單視野下孢子數（8±1）個，發花相對濕度80%，發花時間42 h條件下，發花溫度設置22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃；

豆腐擺坯間距2.0 cm，孢子懸浮液400倍光學顯微鏡單視野下孢子數（8±1）個，發花相對濕度80%，發花溫度28 ℃，發花時間設置38 h、40 h、42 h、44 h；

豆腐擺坯間距2.0 cm，孢子懸浮液400倍光學顯微鏡單視野下孢子數（8±1）個，發花溫度28 ℃，發花時間設置38 h，發花相對濕度設置75%、80%、85%、90%。

分別考察豆腐擺胚間距、毛霉接種量、發花相對濕度、發花時間及發花溫度對白點產生率及腐乳氨基酸態氮含量的影響。

每個工藝參數制作300瓶腐乳，隨機分成三組，每組100瓶。將腐乳置于相同環境下發酵，3個月后統計各參數下產生白點的數量，并計算白點產生率。

1.3.4 工藝參數優化正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇豆腐擺胚間距（1.5cm、2.0cm）、毛霉接種量（顯微鏡單視野下孢子數）（5±1個、8±1個）、發花溫度（25 ℃、28 ℃）、相對濕度（85%、90%）、時間（38 h、40 h）進行5因素2水平正交試驗，以白點產生率及氨基酸態氮含量為評價指標，優化工藝參數。

1.3.5 腐乳品質分析

每個控制因素設100瓶樣品，后酵3個月后對腐乳進行白點觀察和氨基酸態氮含量檢測。每類樣品隨機挑選3瓶進行氨基酸態氮含量檢測，計算平均值。腐乳感官指標、理化指標及微生物指標參照商業標準SB/T 10170—2007《腐乳》[25]中的方法。

1.3.6 數據處理利用SPSS 23.0對試驗數據進行統計分析。正交試驗參考食品試驗設計與統計分析[26]。

2 結果與分析

2.1 腐乳白點定性檢測

腐乳白點在蒸餾水、沸水、0.01mol/L鹽酸溶液、0.01mol/L氫氧化鈉溶液中溶解不明顯，但迅速溶解于88%甲酸溶液。

腐乳白點迅速燃燒，有焦味，燃燒后殘留物少，表明殘留物主要為有機物。

腐乳白點與茚三酮溶液反應呈藍紫色，氨基酸呈色反應說明腐乳白點含有氨基酸，可能為文獻中報道的酪氨酸結晶[24]。

2.2 腐乳生產工藝參數優化單因素試驗

2.2.1 擺坯間距對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響

豆腐擺坯間距對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響見表1。

表1 豆腐間距對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響Table 1 Effect of tofu spacing on production rate of sufu white points and amino nitrogen contents

由表1可知，隨著豆腐擺胚間距的增加，氨基酸態氮的含量逐漸降低。間距0.5 cm與1.0 cm處理組、間距1.5 cm與2.0 cm處理組的腐乳白點產生率均無顯著性差異（P＞0.05），間距0.5 cm與2.0 cm處理組白點產生率有顯著性差異（P＜0.05），表明擺胚間距影響腐乳白點產生率，且在0.5～2.0 cm范圍內，增加擺胚間距，可減少白點產生率；間距0.5 cm、1.0 cm、1.5 cm處理組的氨基酸態氮含量呈顯著性差異（P＜0.05），表明增加豆腐擺胚間距氨基酸態氮的含量隨之下降。擺胚間距過小，白點易生成，影響擺胚皮膜完整性；間距過大又增加空間成本，易造成浪費。擺坯間距＞2.5 cm時，發花過程中豆腐側面毛霉生長到0.5 cm時出現提前倒毛的現象。

不同擺胚間距的腐乳成品見圖1。擺胚間距0.5 cm、1.0 cm（見圖1A和1B）腐乳成品白點產生率高且白點析出密集，擺胚間距1.5 cm、2.0 cm（見圖1C和1D）腐乳成品白點產生率高但白點析出較少。因此，選用擺胚間距1.5 cm與2.0 cm進行正交試驗。

圖1 不同胚間距腐乳成品Fig.1 Sufu products of with different tofu spacing

2.2.2 毛霉接種量對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響

由表2可知，孢子數≤8個時，腐乳白點產生率≤10%，腐乳氨基酸態氮含量≤1.15 g/100 g。當孢子數≥11個時，白點產生率急劇增加，白點產生率≥61%，氨基酸態氮含量≥1.26 g/100 g。接種孢子數越多，氨基酸態氮含量越高，腐乳白點產生率越高；接種孢子數越少，氨基酸態氮含量越低，腐乳白點產生率越低。因此減少接種量可有效減少腐乳白點的產生。盡管發酵時使用的是純種菌種，但是發酵前酵過程是半開放式的，發酵過程容易污染雜菌[27]，因此腐乳發酵是多菌混合發酵。單視野下孢子數5個、8個、11個、14個處理組間的白點產生率有顯著差異（P＜0.05），表明接種量影響腐乳白點產生率，單視野下5～14個范圍內，隨著孢子數的減少，腐乳白點產率逐漸較少；孢子數5個與8個處理組間、孢子數11個與14個處理組間氨基酸態氮含量差異不顯著（P＞0.05），孢子數5個與14個處理組間氨基酸態氮含量有顯著差異（P＜0.05），表明減少接種量可減少氨基酸態氮含量。毛霉孢子接種量＜4個時，豆腐表面毛霉生長狀況不佳，無法形成完整的菌膜，腐乳后酵無法形成塊狀腐乳，影響成品合格率。接種量＞10個時，腐乳成品大量析出白點，影響產品銷售。

表2 接種量對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響Table 2 Effect of inoculum on production rate of white points and amino acid nitrogen contents

不同接種量腐乳成品白點產生情況見圖2。接種孢子數14個的腐乳成品（見圖2A）白點產生率高，且白點析出密集；接種孢子數11個的腐乳成品（見圖2B）白點產生率高，但白點析出少；接種孢子數8個的腐乳成品（見圖2C）腐乳成品少有白點產生；接種孢子數5個的腐乳成品（見圖2D）無白點產生。減少接種量可有效減少腐乳白點的產生。因此，選用毛霉接種量（單視野下5個、8個）進行正交試驗。

圖2 不同毛霉接種量腐乳成品Fig.2 Manufactured products of sufu with different Mucor inoculum

2.2.3 發花溫度對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響

由表3可知，發花溫度不高于28 ℃時，氨基酸態氮含量≤1.22 g/100 g，白點率≤59%；在發花溫度不低于31 ℃時，氨基酸態氮含量≥1.31 g/100 g，白點產生率≥81%。發花溫度25 ℃、28 ℃、31 ℃處理組間，白點產生率有顯著差異（P＜0.05），發花溫度22 ℃與25 ℃處理組間白點產生率無顯著差異（P＞0.05），表明降低發花溫度可減少腐乳白點的產生；發花溫度25 ℃、28 ℃、31 ℃處理組間，氨基酸態氮含量有顯著差異（P＜0.05），發花溫度22 ℃與25 ℃處理組間氨基酸態氮含量無顯著差異（P＞0.05），表明降低溫度可降低氨基酸態氮含量。當發花溫度不高于22 ℃時，出現部分豆坯不生長毛霉，或毛霉長勢較差現象，易造成腐乳后酵豆腐腐敗現象，無法形成塊狀腐乳，影響成品合格率。發花溫度不低于28 ℃時腐乳的氨基酸態氮含量迅速增加，腐乳白點產生率大幅度增加。將發花環境溫度控制在28 ℃時，可有效降低腐乳成品白點的產生。

表3 發花溫度對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響Table 3 Effect of Mucor growth temperature on production rate of white points and amino acid nitrogen contents

不同發花溫度腐乳成品白點產生情況見圖3。發花溫度31 ℃，白點產生率高且較密集；發花溫度25 ℃，無白點的產生。降低發花溫度可有效控制腐乳成品白點的產生。因此，選用溫度（25 ℃、28 ℃）進行正交試驗。

圖3 不同發花溫度腐乳成品Fig.3 Manufactured products of sufu with different Mucor growth temperature

2.2.4 相對濕度對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響

由表4可知，相對濕度≥85%時，氨基酸態氮含量≤1.05 g/100 g，腐乳成品無白點產生；相對濕度≤80%時氨基酸態氮含量≥1.21 g/100 g，且腐乳成品白點產生率≥60%。相對濕度越高，氨基酸態氮的含量越低，白點產生率越低；相對濕度越低，氨基酸態氮的含量越高，白點率越高。相對濕度≥85%，可降低腐乳氨基酸態氮的含量，有利于腐乳白點的控制。相對濕度75%、80%與85%處理組間白點產生率有顯著差異（P＜0.05），相對濕度85%與90%處理組間白點產生率無顯著差異（P＞0.05），相對濕度75%～85%范圍內，表面增加相對濕度可降低腐乳白點的產生；相對濕度75%、80%與85%處理組間氨基酸態氮含量呈顯著差異（P＜0.05），相對濕度85%與90%處理組間氨基酸態氮含量無顯著差異（P＞0.05），表面增加相對濕度可降低氨基酸態氮含量。相對濕度＜80%時，擺坯框四周的豆塊失水變干，但中心處豆塊氨基酸態氮含量較高。相對濕度＞90%時，因相對濕度過高導致毛霉生長過程中含水率過高，壓制毛霉長勢。

表4 相對濕度對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響Table 4 Effect of relative humidity on production rate of white points and amino nitrogen contents of Mucor

不同相對濕度腐乳成品白點產生情況見圖4。發花濕度＜80%（見圖4A）腐乳白點產生率高，但不密集；發花濕度80%～85%（見圖4B）白點產生率稍高，白點析出少；發花濕度85%～90%（見圖4C和圖4D）腐乳未見白點生成。適宜的發花濕度可以減少白點的產生。因此，選擇相對濕度（85%～88%、88%～90%）進行正交試驗。

圖4 不同發花濕度腐乳成品Fig.4 Manufactured products of sufu with different Mucor growth humidity

2.2.5 發花時間對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響

由表5可知，發花時間≤40 h，氨基酸態氮含量≤1.14 g/100 g，腐乳白點產生率≤10%。發花時間≥42 h，氨基酸態氮含量≥1.28 g/100 g，腐乳白點產生率≥58%。發花時間38 h、40 h、42 h與44 h處理組間白點產生率有顯著差異（P＜0.05），表明減少發花時間可降低腐乳白點產生率；發花時間38 h、40 h與42 h處理組間氨基酸態氮含量呈顯著差異（P＜0.05），發花時間42 h與44 h處理組間氨基酸態氮含量差異不顯著（P＞0.05），表明減少發花時間可降低腐乳氨基酸態氮含量。發花時間低于30 h時毛霉生長不佳，豆坯未形成完整的皮膜，腐乳后酵后易出現腐乳融化現象，無法形成塊狀腐乳。發花時間≥45 h，腐乳白點產生率顯著增加，同時部分豆坯毛霉生長孢子，出現發黑現象。

表5 發花時間對腐乳白點產生率及氨基酸態氮含量的影響Table 5 Effect of Mucor growth time on production rate of white points and amino nitrogen contents

不同發花時間腐乳成品白點產生情況見圖5。發花45 h（見圖5A）腐乳白點產生率高且稍密集；發花42 h（見圖5B）腐乳白點產生率高且稍密集；發花40 h（見圖5C）腐乳白點產生率低且白點析出少；發花38 h（見圖5D）未見腐乳白點產生。因此，選用發花時間（38 h、40 h）進行正交試驗。

圖5 不同發花時間腐乳成品Fig.5 Manufactured products of sufu with different Mucor growth time

2.3 工藝參數優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以白點產生率及氨基酸態氮含量為評價指標，分別選擇豆腐擺胚間距（1.5 cm、2.0 cm）、毛霉接種量（5個、8個）、發花溫度（25 ℃、28 ℃）、相對濕度（85%、90%）、發花時間（38 h、40 h）進行5因素2水平正交試驗。正交試驗結果與分析見表6。

表6 腐乳工藝參數優化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for process parameter optimization of sufu

續表

由表6可知，以白點產生率為評價指標，影響白點產生率的主次因素順序為C＞A＞E＞D＞B，最佳生產工藝組合為A2B2C2D1E1，即擺坯間距2.0 cm、發花溫度28 ℃、發花相對濕度90%、發花時間38 h、400倍光學顯微單視野下孢子數5個，此時無腐乳白點產生；以氨基酸態氮含量為評價指標，影響氨基酸態氮含量的主次因素順序為C＞A＞D＞B=E，最佳生產工藝組合為A2B1C2D1E1，即擺坯間距2.0 cm、發花溫度25 ℃、發花相對濕度90%、發花時間38 h、400倍光學顯微單視野下孢子數5個。由正交試驗可得氨基酸態氮含量1.09 g/100 g是腐乳白點產生的臨界點，氨基酸含量＜1.09 g/100 g時不產生白點，此時腐乳白點產生率低，同時擁有較高的氨基酸態氮含量。因此，最佳生產工藝組合為A1B2C2D2E2，即擺坯間距1.5 cm、接種量孢子數控制8個、發花溫度28 ℃、發花濕度90%、發花時間40 h。在此工藝參數條件下，成品腐乳氨基酸態氮含量為1.09 g/100 g，未見腐乳白點產生。

3 結論

本試驗得出隨著擺坯間距的增大，氨基酸態氮的含量逐漸降低，最佳擺坯間距為2 cm；隨著接種量的減少，腐乳氨基酸態氮的含量逐漸減少，最佳毛霉接種量（400倍光學顯微鏡單視野下孢子數）為5個；隨著發花溫度的降低，氨基酸態氮含量逐漸降低，最佳發花溫度為25 ℃；隨著發花濕度的增加，氨基酸態氮的含量逐漸減少，發花相對濕度最佳為90%；隨著發花時間的延長，氨基酸態氮含量逐漸增加，最佳發花時間為38 h。結果表明，氨基酸態氮＜1.09 g/100 g時，未觀察到腐乳白點。因此降低腐乳白點的產生率，可通過減少腐乳氨基酸態氮的含量實現。