響應面法優化發酵型黑米蜂蜜酒加工工藝

張 杰，游新俠，陳彥彥，段秋虹*

（鄭州科技學院 食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064）

黑米屬于糯米類，呈黑色或者褐色，營養豐富，自古有“藥米”、“貢米”、“壽米”之稱[1]，現代醫學表明，黑米具有預防心腦血管疾病，降低甘油三酯、膽固醇，滋陰養腎，健脾開胃，促進兒童骨骼增長，大腦發育等功效[2-3]。

蜂蜜酒是以蜂蜜和水為原料釀制而成的飲料酒，按生產工藝可以分為發酵型蜂蜜酒和蒸餾型蜂蜜酒[4-5]。因蜂蜜價格高昂，蜂蜜酒被稱為貴族酒[6]。近年來關于傳統蜂蜜酒的工藝優化及新型蜂蜜酒的研制多參照米酒、露酒和發酵酒的國家標準[7-11]，直到2020年，陶樹興等[4]起草并通過了QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》的行業標準，規定了蜂蜜酒的術語和定義、技術要求、分析方法、檢驗規則和標志、包裝、運輸和儲存，使得蜂蜜酒的研制、生產、檢驗和銷售得以正規化。

我國對蜂蜜酒的研究較少，目前研究主要集中在純蜂蜜酒[12-15]、中草藥蜂蜜酒[16-19]和水果蜂蜜酒[20-23]等幾個方面，對谷物蜂蜜酒的研制鮮有研究報道。杜剛等[15]從云南文山蜂蜜中分離純化出5株酵母菌，以菌株Y3作為發酵菌株對蜂蜜稀釋液進行發酵，制得的純蜂蜜酒酒香和果香濃郁，其中含有41種揮發性成分。鄧加聰等[16]以南平野花蜂蜜、百合酶解液和紅曲作為原輔料，制得一款色澤清亮、酒香純正、具有營養保健價值的紅曲百合蜂蜜酒。鄒璐[22]以紅棗、蜂蜜和水為原材料，通過單因素試驗和正交試驗優化紅棗汁的浸提工藝和蜂蜜酒的發酵工藝，制得一款酒體協調、香味濃郁、酒精度為17.9%vol的發酵型紅棗蜂蜜酒。國外KOGUCHI M等[24-25]研究發現，黑米和精白米能夠顯著提高蜂蜜酒的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，但未對谷物類蜂蜜酒加工工藝進行優化。因此，本研究以黑米和蜂蜜為試驗材料，以感官評價為評價指標，通過單因素和響應面試驗優化黑米蜂蜜酒發酵工藝，旨在得到黑米蜂蜜酒的最佳發酵工藝條件，既能提高酒精度，又能保留蜂蜜酒特有的風味，為谷物類蜂蜜酒的多樣化發展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：延壽縣李氏米業有限公司；深山百花蜜（白利度≥42°Bx）：山東歸農養蜂股份有限公司；甜酒曲、高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；純凈水：華潤怡寶飲料有限公司。

1.2 儀器與設備

KFS-A1型電子稱：浙江凱豐集團有限公司；CFXB40BE型電飯煲：廣東浩特電器有限公司；LRH-150F型恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-50A型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SN-HWS-26型恒溫水浴鍋：上海尚儀儀器設備有限公司；RHB-32ATC型糖度計：上海天壘儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米蜂蜜酒釀造工藝流程[13]

1.3.2 操作要點

選米：稱取適量的黑米，去除黑米中的雜質、塵土、碎米與細糠。

浸泡：將黑米洗凈放置于潔凈容器中，加入清水沒過黑米浸泡12 h。

蒸煮：黑米瀝干水分后放置于蒸鍋中，按照液料比6∶1（mL∶g）加入冷水，表面打出小孔，常壓蒸煮40 min左右。

淋飯冷卻：把蒸好的黑米倒入潔凈容器中，用涼開水沖淋黑米表面至易攪拌，再用筷子攤勻，使米飯內外溫度冷卻至30 ℃左右。

拌曲糖化：選取適量的安琪酒曲，少量多次的灑在黑米上并攪拌均勻，用手輕輕壓實，再在表面加入少量的酒曲，黑米中間挖出酒窩，增大與空氣的接觸面積。

發酵：糖化結束后，接入適量活性干酵母以及與黑米質量比1∶1的純凈水，置于恒溫培養箱中32 ℃發酵72 h，至發出濃厚的酒香。

過濾澄清：發酵好的蜂蜜酒用滅菌過的多層紗布過濾3次，靜置澄清。

滅菌：取澄清液的上清液，于80 ℃的條件下滅菌15～20 min，得到黑米蜂蜜酒。

1.3.3 黑米蜂蜜酒發酵工藝優化單因素試驗設計

在前人研究的基礎上[24-25]，以100 g黑米為基準，蜂蜜與黑米質量比分別為4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100（g∶g），酒曲添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（均以100 g黑米質量計），發酵溫度分別為26℃、29℃、32℃、35℃、38℃，發酵時間分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，探究蜂蜜與黑米質量比、酒曲添加量、發酵溫度及發酵時間對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響，以感官評價為主要評價標準。

1.3.4 黑米蜂蜜酒發酵工藝優化響應面試驗

以單因素試驗結果為依據，選取對結果影響較大的蜂蜜與黑米質量比（A）、酒曲添加量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為自變量，以感官評分為響應值（Y），采用4因素3水平的Box-Behnken響應面試驗進行發酵工藝優化，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 黑米蜂蜜酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of black rice mead

1.3.5 黑米蜂蜜酒感官評價

黑米蜂蜜酒感官評分參照中華人民共和國輕工行業標準QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，取50 g樣品于干凈的透明玻璃杯中，在自然光亮處，由10人組成評價小組，對酒液進行評價，主要從色澤（10分）、香味（30分）、滋味（50分）、外觀（10分）四個方面依次對成品進行評分，總分為100分，黑米蜂蜜酒的感官評分標準見表2。

表2 黑米蜂蜜酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of black rice mead

1.3.6 分析檢測

酒精度的測定參照國標GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》的酒精計法測定；總酸、揮發性酸和總糖按國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定。

1.3.7 數據處理

本試驗數據分析采用Excel 2019和Design Expert.V8.0.6軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 蜂蜜與黑米質量比對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

蜂蜜與黑米質量比對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響見圖1。由圖1 可知，當原料比處于4∶100～6∶100（g∶g）時，蜂蜜酒中的蜂蜜風味較淡，酒精度較低；當蜂蜜與黑米質量比在6∶100時，酒體風味協調，口味較好，酒精度較高，為11.4%vol，此時蜂蜜酒感官評分最高，為82.3分；隨著蜂蜜與黑米質量比的不斷增加，初始糖度逐漸增大，當蜂蜜與黑米質量比＞8∶100（g∶g）時，酒液開始變渾濁，高滲透壓抑制了部分釀酒酵母的生物活性[5，14]，酒精度有所下降，蜂蜜味較濃，感官評分有所降低。綜合考慮，最佳蜂蜜與黑米質量比為6∶100。

圖1 蜂蜜與黑米質量比對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響Fig.1 Effects of mass ratio of honey and black rice on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.1.2 酒曲添加量對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

酒曲添加量對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響見圖2。由圖2可知，隨著酒曲添加量在0.2%～1.0%范圍內的增加，蜂蜜酒的酒精度與感官評分呈現出先上升后下降的趨勢。當酒曲添加量在0.2%～0.6%時，蜂蜜酒的酒精度與感官評分隨酒曲添加量增加而增高；當酒曲添加量在0.6%時，蜂蜜酒的酒精度與感官評分最高，分別為11.4%vol、80.4分；當酒曲添加量＞0.6%之后，過量的酵母會額外消耗掉蜂蜜酒中的糖分用于生長繁殖，不利于酒精發酵，酒精度有所下降，導致黑米蜂蜜酒整體風味有所下降[13]。綜合考慮，酒曲的最佳添加量為0.6%。

圖2 酒曲添加量對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響Fig.2 Effects of Jiuqu addition on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.1.3 發酵溫度對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

發酵溫度對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價品質的影響見圖3。由圖3可知，當蜂蜜酒發酵溫度為26～32 ℃時，黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價隨發酵溫度增加而逐漸提高，由于溫度偏低導致微生物發酵不完全，酒香味低，黑米風味不明顯；當發酵溫度達到32 ℃時，發酵速度明顯加快，微生物代謝旺盛，酒香味明顯，此時酒精度及感官評分最高，分別為11.4%vol、82.7分；當發酵溫度高于32 ℃之后，微生物生長繁殖加快，容易造成酵母菌早衰，而雜菌代謝旺盛[26]，酒精度降低，蜂蜜酒品質迅速變差，同時酒體開始渾濁，導致感官評價值偏低。綜合考慮，最佳發酵溫度為32 ℃。

圖3 發酵溫度對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.1.4 發酵時間對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

發酵時間對黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響見圖4。由圖4可知，隨著發酵時間在24～120 h范圍內的增加，蜂蜜酒的感官評分呈現先迅速增加后緩慢降低的趨勢，酒精度呈現先迅速升高后趨于不變的趨勢。當發酵時間為24～72 h時，黑米蜂蜜酒酒精度與感官評價隨發酵時間增加而逐漸提高，由于發酵時間較短，大部分釀酒酵母處于增殖階段，酒精產量較少，酒精度較低，導致風味相對不明顯；當發酵時間在72 h時，蜂蜜酒感官評分最高，為81.9分，酒精度為11.5%vol；而當發酵時間＞72 h之后，由于發酵時間較長，酒精度雖然仍緩慢升高，但由于菌體開始出現衰亡自溶，口感會呈現出苦味，酒體不協調，導致感官評分較低[18]。綜合考慮，最佳發酵時間為72 h。

圖4 發酵時間對黑米蜂蜜酒產品酒精度與感官評價的影響Fig.4 Effects of fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.2 發酵工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

在單因素試驗結果基礎上，以感官評分作為響應值（Y），蜂蜜與黑米質量比（A）、酒曲添加量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為自變量，采用響應面法進行優化，篩選出黑米蜂蜜酒的最佳發酵工藝條件，響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 黑米蜂蜜酒的響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for black rice mead

續表

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert.V8.0.6軟件對表3中的結果進行回歸擬合和方差分析，得到模型的二次多項回歸方程為：

根據表4可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.720 0＞0.05），表明理論和實際值偏差很小，擬合度較高，得到的方程可以很好地預測結果。一次項A、B、D對黑米蜂蜜酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）。決定系數R2=0.970 4，調整決定系數R2adj=0.940 9，可知此模型中的94.09%黑米蜂蜜酒的感官評分變化來自于自變量A、B、C、D。通過F值和顯著水平得到影響感官評分的各因素順序為酒曲添加量（B）＞發酵時間（D）＞原料比（A）＞發酵溫度（C）。

2.2.2 響應面交互作用

各因素交互作用對黑米蜂蜜酒感官評分影響的響應曲面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對黑米蜂蜜酒感官評分影響的響應面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of black rice mead

由圖5可知，當原料比（A）、酒曲添加量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）兩兩交互作用時，對黑米蜂蜜酒感官評價均有影響，但影響不夠顯著，各響應曲面陡峭程度存在一定差異。AB坡面上感官評分隨著A、B的增加呈現先快速升高后緩慢降低的趨勢，AC、AD、BC、BD、CD坡面上感官評分隨著A、B、C、D的增加均呈現先緩慢升高后快速降低的趨勢，能夠說明存在感官評分的最大值點。

由Design Expert.V8.0.6軟件預測得出黑米蜂蜜酒最佳發酵工藝為：蜂蜜與黑米質量比6∶100（g∶g）、酒曲添加量0.56%、發酵溫度32.50 ℃、發酵時間78.11 h，此時感官評分理論值為85.7分。為了便于實際操作，將發酵工藝修正為蜂蜜與黑米質量比6∶100（g∶g）、酒曲添加量0.6%、發酵溫度33 ℃、發酵時間78 h。在此優化發酵工藝下進行3次平行驗證試驗，感官評分實際值為87.1分，與預測值相差不大，表明該工藝可行。

2.3 產品理化指標檢測結果

將優化工藝釀制出的黑米蜂蜜酒進行理化指標檢測，結果見表5。

表5 黑米蜂蜜酒理化檢測結果Table 5 Physical and chemical test results of black rice mead

3 結論

通過單因素及響應面試驗得到黑米蜂蜜酒最佳發酵工藝條件為蜂蜜與黑米質量比6∶100、酒曲添加量0.6%、發酵溫度33 ℃、發酵時間78 h。在此優化條件下，感官評分為85.7分，酒精度為12.7%vol，總酸（以乙酸計）為4.5 g/L，揮發性酸（以乙酸計）為0.8 g/L，總糖為57.2 g/L。黑米蜂蜜酒呈酒紅色，酒體協調，色澤均勻，底部無明顯沉淀物，酒味濃郁無明顯酸味和苦澀味，兼有黑米和蜂蜜特殊風格，口感更為爽口。本研究可為我國蜂蜜酒大規模工業化生產提供理論基礎。