提取方法對香蕉皮粗多糖的組成、性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響

劉小辰，林海龍*

（國投生物科技投資有限公司，北京 100034）

香蕉（Musa nana）屬于芭蕉科芭蕉屬植物，廣泛種植于熱帶地區(qū)[1]。作為世界上栽培香蕉的古老國家之一，我國也有大面積栽培[2]。香蕉因其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、口感甚佳深受人們的喜愛。香蕉皮占香蕉總質(zhì)量的30%～40%[3]，在加工后一般會被直接丟棄，不僅會造成資源浪費(fèi)，還會對環(huán)境造成污染。國內(nèi)外有很多對香蕉的研究，但多數(shù)集中在香蕉果肉上，對香蕉皮的研究和利用較少。

多糖（polysaccharides）是近年來研究的熱點(diǎn)，其具有多種生理功能如抗氧化[4]、降血糖血脂[5]、降膽固醇、抗腫瘤[6]、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道菌群[7]、保濕[8]等。香蕉皮中含有大量多糖，具有很大的應(yīng)用潛力。王麗娟等[9]采用熱水提取法從香蕉皮中提取多糖，香蕉皮粗多糖（banana peel crude polysaccharide，BPCP）得率為4.25%。朱開梅等[10]則進(jìn)一步在熱水浸提的基礎(chǔ)上加入超聲輔助，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，最終香蕉皮多糖得率可達(dá)13.85%，且該多糖對人乳癌細(xì)胞MCF-7具有顯著的抑制作用。趙廣河等[11]通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了酸提與酶提香蕉皮多糖的工藝，并對提取效果進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)酶法提取的得率明顯高于酸法提取[12]。

為了比較不同提取方法對香蕉皮粗多糖（BPCP）結(jié)構(gòu)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提（hot water extraction，HWE）、酸輔助提取（acid assisted extraction，ACAE）、堿輔助提取（alkali assisted extraction，ALAE）、酶法浸提（enzyme extraction，EE）、高壓熱水提取（high pressure hot water extraction，HPHWE）、超聲熱水提取（ultrasonic hot water extraction，UHWE）等6種方法進(jìn)行香蕉皮粗多糖（BPCP）的提取，比較不同提取方法下BPCP化學(xué)組成、分子質(zhì)量、單糖組成、表觀結(jié)構(gòu)、表觀黏度等性質(zhì)的差異，以期為香蕉副產(chǎn)物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉皮：市售香蕉的皮；果膠酶（酶活5 U/mg）、纖維素酶（酶活10 U/mg）、牛血清蛋白（純度≥98%），葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；拜耳醫(yī)藥保健有限公司；體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、苯酚、濃硫酸、鹽酸、考馬斯亮藍(lán)（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市子華儀器有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Waters-2998紫外檢測器：美國Waters公司；DAWN HELEOS-II激光光散射儀：美國Wyatt公司；Bruker VERTEX 33傅里葉變換紅外光譜：德國Bruker公司；S-3400N掃描電子顯微鏡：日本Hitach公司；HAAKE MARS流變儀：美國熱電公司；Alpha 1-4 LD冷凍干燥機(jī)：德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉皮粗多糖提取方法及制備

熱水浸提法（HWE）[9]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

酸輔助提取（ACAE）[13]：取香蕉皮100 g加入1 L檸檬酸（pH值為2）打漿，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

堿輔助提取（ALAE）[13]：取香蕉皮100 g加入1 L NaOH（0.5 mol/L）打漿，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

酶法浸提（EE）[14]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，調(diào)pH至6.0（0.1 mol/L NaOH），加入0.5%果膠酶和1.0%纖維素酶，于50 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

高壓熱水提取（HPHWE）[15]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，在115 ℃、0.2 MPa條件下提取2 h。

超聲熱水提取（UHWE）[16]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，在超聲功率400 W、50 ℃條件下處理30 min，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

香蕉皮粗多糖提取結(jié)束后，冷卻至室溫，8 000 r/min離心15 min，200目紗布過濾得上清液，加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，4 ℃條件下醇沉24 h，10 000 r/min離心20 min收集沉淀，超純水沉淀復(fù)溶，減壓旋蒸除去乙醇。再經(jīng)過5 kDa超濾膜進(jìn)行超濾，收集大分子，減壓旋蒸（溫度60 ℃，真空度0.1 MPa），-40 ℃凍干24 h得到香蕉皮粗多糖。

1.3.2 分析與檢測

總多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[17]。將粗多糖配制為0.1 mg/mL的溶液，移取1 mL樣品溶液于玻璃試管中，加入1 mL 現(xiàn)配的6%苯酚溶液與5 mL濃硫酸，充分振蕩混勻后靜置反應(yīng)25 min，于波長490 nm處測定吸光度值。用蒸餾水代替樣品溶液，作為空白對照測定其吸光度值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總多糖的含量。

總蛋白含量的測定：采用Bradford法[18]。將粗多糖配制為0.1 mg/mL的溶液，移液槍移取50 μL樣品溶液，滴加到96孔板中，再加入200 μL的考馬斯亮藍(lán)試劑。靜置10 min后，用酶標(biāo)儀在波長595 nm處測得溶液的吸光度值。用磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，作為空白對照測定其吸光度值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

分子質(zhì)量分布測定[19]：采用凝膠色譜法（gel permeation chromatography，GPC）測定多糖分子質(zhì)量。將香蕉皮粗多糖配制為質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，進(jìn)樣量為20 μL，Ultrahydrogel保護(hù)柱（40 mm×6 mm），Ultrahydrogel 2000 SEC色譜柱（7.8 mm×300 mm）和Ultrahydrogel 1000 SEC（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)使用，柱溫30 ℃，以超純水為流動相，流速0.5 mL/min，采用示差檢測器（refractive index detector，RID）檢測多糖峰。用葡聚糖標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品分子質(zhì)量。

單糖組成分析：采用高效液相色譜法[20]，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱，柱溫30 ℃，流動相為0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）和乙腈的混合溶液（83∶17，V/V）。控制流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為245 nm。

傅里葉變換紅外光譜分析[21]：1 mg樣品與100 mg KBr混合并充分研磨至均勻粉末，壓片。于波數(shù)3 750～500 cm-1范圍掃描，分辨率為4 cm-1。

掃描電子顯微鏡觀察[22]：樣品放于雙面膠帶上并噴薄金層，以15.0 kV的加速電壓于掃描電子顯微鏡觀察臺上收集圖像，放大倍數(shù)為1 000。

流變學(xué)特性測定[22]：分別配制質(zhì)量濃度為10 g/100 mL的樣品溶液，于20 ℃、剪切速率1～100 s-1條件下使用流變儀測定不同BPCP的表觀黏度。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（n=3）。使用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的化學(xué)組成

不同提取方法得到的香蕉皮粗多糖的化學(xué)組成見表1。由表1可知，提取方式對粗多糖的總多糖、總蛋白含量有顯著影響。與其他提取方式相比，BPCP-ACAE的總多糖含量較低（7.54%），這可能是由于酸提取的樣本中含有大量酚類、色素等。通過其他方式獲得的粗多糖中總多糖含量都在30%以上，其中BPCP-UHWE總多糖最高（39.62%）。BPCP-ACAE和BPCP-HPHWE中不含蛋白質(zhì)，BPCP-ALAE中總蛋白含量最高（17.77%）。因此，香蕉皮粗多糖更適合采用超聲熱水提取的方法制備。

表1 不同提取方法對香蕉皮粗多糖化學(xué)組成的影響Table 1 Effect of different extraction methods on the chemical composition of banana peel crude polysaccharides

2.2 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的分子質(zhì)量分布情況

不同提取方式得到的香蕉皮粗多糖的平均分子質(zhì)量分布情況見表2。由表2可知，不同提取方式制備的香蕉皮粗多糖分子質(zhì)量分布有顯著差異。BPCP-HPHWE多為分子質(zhì)量較小的多糖，其分子質(zhì)量為2.68 kDa的多糖占94.4%，說明BPCP-HPHWE分子質(zhì)量分布較為集中。

表2 不同提取方法對香蕉皮粗多糖分子質(zhì)量分布的影響Table 2 Effect of different extraction methods on the molecular mass distribution of banana peel crude polysaccharides

2.3 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的單糖組成

由表3可知，幾種BPCP的單糖組成差異顯著，均含有甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。BPCP-ACAE中不含有鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖；BPCP-ALAE不含有半乳糖；BPCP-HPHWE不含有葡萄糖、阿拉伯糖；BPCP-HWE不含有氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖；BPCP-UHWE、BPCP-EE均不含有氨基葡萄糖、木糖。不同的制備手段對細(xì)胞壁的破壞程度不同，進(jìn)而導(dǎo)致溶出物的組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，這可能是本研究獲得的六種多糖在單糖組成上明顯差異的關(guān)鍵因素[23-24]。

表3 不同提取方法對香蕉皮粗多糖的單糖組成的影響Table 3 Effect of different extraction methods on monosaccharide composition of banana peel crude polysaccharide

2.4 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖傅里葉變換紅外光譜結(jié)果

由圖1可知，粗多糖在3 750～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)具有明顯的多糖特征吸收峰。波數(shù)3 340 cm-1處的吸收峰為O-H的伸縮振動峰，波數(shù)2 931 cm-1附近的吸收峰與糖環(huán)中C-H的伸縮振動有關(guān)[25]。波數(shù)1 750 cm-1處的吸收峰是由C=O的伸縮振動引起的[25]，波數(shù)1 600 cm-1和1 410 cm-1處的吸收峰是由羧基（COO-）的非對稱和對稱伸縮振動引起的[27]，波數(shù)1 200～1 000 cm-1范圍的兩個(gè)吸收峰證明了吡喃糖苷的存在[28]。不同提取方式得到的香蕉皮粗多糖有機(jī)官能團(tuán)組成無明顯差異。

圖1 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of banana peel crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.5 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖分子形態(tài)觀察結(jié)果

不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的掃描電鏡圖結(jié)果圖2。由圖2可知，BPCP-HWE與BPCP-UHWE有著相似的結(jié)構(gòu)，表面光滑，分子間結(jié)合緊密；BPCP-HPHWE表面光滑，整體結(jié)構(gòu)呈乳液狀；BPCP-ALAE、BPCP-EE、BPCP-ACAE均為分散型結(jié)構(gòu)，其中BPCP-ALAE、BPCP-ACAE呈顆粒狀聚集，BPCP-EE呈碎片狀、表面疏松多孔。可能是不同處理方式獲取的多糖種類不同，以及對糖苷鍵及多糖鏈內(nèi)與鏈間的氫鍵破壞程度不同，進(jìn)而造成多糖表面微觀結(jié)構(gòu)的明顯差異[29]。

圖2 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of banana peel crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖流變學(xué)特性結(jié)果

不同提取方法得到香蕉皮粗多糖流變特性見圖3。由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)涉及的剪切速率范圍內(nèi)，BPCP-HWE（0.006～0.023 mPa·s）和BPCP-UHWE（0.006～0.016 mPa·s）的黏度始終高于其他幾種多糖，具有更大分子質(zhì)量的BPCP-ACAE表觀黏度則比較小（0.001～0.005 mPa·s），說明分子質(zhì)量不是影響B(tài)PCP黏度的主要因素。但是結(jié)合SEM表觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果可以看出，BPCP-UHWE與BPCP-HWE有相似的結(jié)構(gòu)，均為比較大的塊狀固體，說明其分子間結(jié)合比較緊密，這可能是造成其高黏度的原因。隨著剪切速率的增加，BPCP的黏度也隨之下降，呈現(xiàn)明顯的剪切稀化現(xiàn)象[30]，這是因?yàn)樵诟呒羟兴俾氏露嗵侨芤褐械姆肿咏宦?lián)會因?yàn)橥饬Φ淖饔脭嗔眩斐扇芤吼ざ鹊南陆礫19]。

圖3 不同提取方法對香蕉皮粗多糖流變特性的影響Fig.3 Effects of different extraction methods on the rheological properties of banana peel crude polysaccharides

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對比了6種不同提取方法對BPCP的化學(xué)組成、分子質(zhì)量、單糖組成、表觀結(jié)構(gòu)、表觀黏度等的影響。結(jié)果表明，BPCP-UHWE總多糖含量最高（39.62%），BPCP-ALAE中總蛋白含量最高（17.77%）；不同BPCP的平均分子質(zhì)量分布及單糖組成存在明顯差異；BPCP-W與BPCP-UHWE均為分子間結(jié)合比較緊密大塊狀結(jié)構(gòu)，表面光滑；BPCP-HPHWE表面很光滑，呈乳液狀；BPCP-ALAE、BPCP-ACAE呈顆粒狀聚集，BPCP-EE呈碎片狀、表面疏松多孔。BPCP的表觀黏度與其平均分子質(zhì)量大小無關(guān)，而與其表觀結(jié)構(gòu)明顯相關(guān)。綜上所述，不同提取方法對BPCP的化學(xué)組成、分子質(zhì)量、單糖組成、表觀結(jié)構(gòu)、表觀黏度等均有較大的影響。