枇杷-貢梨復合果酒發酵工藝的優化

孟金明，劉秋鳴，熊思敏，郭慧芝，吳 娜*

（紅河學院 化學與資源工程學院，云南 蒙自 661100）

枇杷（Eriobotrya japonica）對于我國南方來說是一種珍稀的特色果品，蒙自長虹枇杷果實果肉鮮嫩多汁、甜中帶酸、風味獨特，一直深受人們的歡迎[1-3]。梨和枇杷一樣屬于薔薇科，其中貢梨表皮金黃，果肉鮮嫩多汁，口感香脆，深受廣大消費者喜歡[4-6]。果酒是以各種水果或果汁為原料，通過自然發酵或人工添加酵母菌釀造而成的低酒精度飲料酒，果酒不僅保留了水果中絕大部分的營養物質，而且水果經發酵產生多種功能性成分，因而果酒具備較好的保健功能[7]。目前對于果酒發酵工藝的研究主要集中在葡萄酒等單一品種果酒，對于使用兩種及以上水果為原料釀造復合果酒的研究呈逐漸上升的趨勢[8-9]。目前，大部分對枇杷和貢梨的研究主要集中在保鮮、活性成分提取以及果脯類食品的加工等方面，而對于將兩者釀制成果酒的研究鮮有報道[11-12]。枇杷和梨同屬于藥食同源的食物，在中醫中均具有生津健胃、潤肺止咳之功效，因此將兩者釀制成復合果酒，不僅可以豐富果酒的品種，還能賦予果酒多種保健功效，復合消費者對于健康飲食的需求。本研究以枇杷與貢梨為原料，采用單因素試驗和響應面試驗優化枇杷-貢梨復合果酒的發酵工藝，釀造出綠色營養滿足廣大消費者需求的復合果酒，不僅可以解決水果資源因不易貯藏和保鮮造成的浪費問題，而且可以豐富市場上果酒的種類，滿足人們對復合果酒的不同消費需求；還可以對枇杷和貢梨的深加工產業提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷：蒙自長虹星；貢梨：市售。纖維素酶（80 000 U/g）、果膠酶（80 000 U/g）、焦亞硫酸鉀、檸檬酸：友誼食品添加劑公司；果酒酵母：安琪酵母有限公司；甲醇、乙醇（均為色譜純）：天津化學試劑三廠；維生素C、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、硫酸、酚酞（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗室用水均使用蒸餾水。

1.2 儀器與設備

GC-2010型氣相色譜儀：日本島津有限責任公司；GSP-9160MBE型隔水式恒溫培養箱：上海博訊實業有限公司；CP224C型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海雷磁-上海儀電科學儀器股份有限公司；手持糖度計LB90A：廣州市銘睿電子科技有限公司；JYLY15型九陽高速破壁調理機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷-貢梨復合果酒加工工藝流程

1.3.2 操作要點

預處理：挑選無機械破損、成熟的新鮮長虹枇杷果實，洗凈，在95 ℃的沸水中熱燙20～30 s后放入冷水冷卻，去除果皮、果核、白膜，將果肉放入含有0.05%維生素C和0.15%檸檬酸的護色液中浸泡10 min，取出放入榨汁機中破碎打漿；選擇無蟲害、成熟度的貢梨，洗凈，去除果皮和果核，切成小塊，放入護色液中浸泡10 min，取出放入榨汁機中，加入0.1%的維生素C破碎打漿。

酶解：將枇杷汁和貢梨汁按一定比例混合，按0.1 g/L的用量分別加入纖維素酶和果膠酶，50 ℃恒溫水浴攪拌3 h，酶解后迅速加熱至90 ℃滅酶5 min，冷卻備用。

調配：添加適量偏重亞硫酸鉀，用白砂糖調節果汁糖度，用檸檬酸調節果汁的pH。

酵母活化：稱取1g的活性干酵母于燒杯中，再加入10mL 2%的葡萄糖溶液，在37 ℃條件下活化30～40 min。

過濾、澄清：發酵結束后，用過濾袋分離果酒和果渣，即得枇杷-貢梨復合果酒。

1.3.3 枇杷-貢梨復合果酒發酵工藝優化單因素試驗

枇杷汁和貢梨汁體積比的確定：將破碎打漿后的枇杷汁和貢梨汁分別按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的體積比進行混合，調整初始糖度240 g/L、初始pH4.0、酵母接種量為0.10%、SO2添加量為40 mg/L，置于20 ℃的條件下發酵，以感官評分和酒精度為評價指標，并考察枇杷汁和貢梨汁體積比對復合果酒發酵的影響。

初始pH值的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入40 mg/L的SO2（焦亞硫酸鉀），初始pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，接入0.1%的酵母，在22 ℃的條件下發酵7 d，測定果酒的酒精度及殘糖量，并考察初始pH值對復合果酒發酵的影響。

酵母添加量的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入40 mg/L的SO2，初始pH值為4.5，分別接入0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%的活化酵母，在22 ℃的條件下發酵7 d，測定果酒的酒精度及殘糖量，并考察酵母添加量對復合果酒發酵的影響。

發酵溫度的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入40 mg/L的SO2，初始pH值為4.5，接入0.2%的酵母、分別置于20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃和28 ℃的條件下發酵7 d，測定果酒的酒精度及殘糖量，并分析發酵溫度對復合果酒發酵的影響。

SO2添加量的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入0、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的SO2，初始pH值為4.5，接入0.2%的酵母、在22 ℃的條件下發酵7 d，測定果酒的酒精度及殘糖量，并考察SO2添加量對復合果酒發酵的影響。

1.3.4 枇杷-貢梨復合果酒發酵工藝優化響應面試驗

根據單因素的試驗結果，從中選擇初始pH值（A）、酵母添加量（B）、發酵溫度（C）和SO2添加量（D）4個因素為自變量，以酒精度（Y）作為響應值，采用4因素3水平的響應面試驗分析法，對發酵工藝條件進行優化[13]。響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

1.3.5 理化指標測定

酒精度測定：采用密度瓶法；總糖測定：采用直接滴定法[14]。

1.3.6 感官指標測定

枇杷-貢梨復合果酒感官評價參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，請經果酒感官培訓的10 位人員，對果酒色澤、透明度、香氣、滋味和典型性5 項指標進行評價，取平均值作為最終感官得分[15]。

表2 枇杷-貢梨復合果酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of loquat-pear compound fruit wine

續表

1.3.7 數據分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對響應面試驗數據進行分析。采用Origin 8.5軟件進行數據的初步處理及作圖，用SPSS Statistics 19.0軟件進行顯著性分析，認為P＜0.05時差異顯著，試驗結果用“均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 枇杷-貢梨復合果酒單因素試驗

2.1.1 果汁混合比例的確定

由圖1可知，枇杷汁與貢梨汁的不同體積比對復合果酒的感官品質影響較大，枇杷經榨汁所得枇杷汁相比于梨汁而言較濃稠，當枇杷汁比例過高時酒體顏色加深，澄清度有所下降，造成果酒感官品質的下降；而當梨汁含量較高時果酒顏色較淺，酒體果香不夠突出。枇杷汁與貢梨汁體積比為1∶2時，果酒的感官評分是最高的，達到81.33分，復合果酒顏色為淡黃色，口感較為柔和，同時含有兩種水果的風味，枇杷香氣特征突出。不同的枇杷汁與貢梨汁體積比對酒精度的影響不大，酒精度基本處于12%vol～12.5%vol范圍內且組間差異不顯著（P＞0.05）；果酒的酒精度主要與初始糖度相關，雖然發酵的果汁比例不同但是發酵初始糖度一致，所以所得果酒的酒精度變化不大。因此，選擇枇杷汁與貢梨汁的最佳體積比為1∶2。

圖1 不同枇杷汁與貢梨汁的體積比對枇杷-貢梨復合果酒品質的影響Fig.1 Effect of different volume ratio of loquat juice and pear juice on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.2 不同初始pH對枇杷-貢梨復合果酒發酵的影響

由圖2可知，隨著發酵液初始pH值的升高，復合果酒酒精度呈先上升后下降的趨勢，殘糖量逐漸降低。當發酵液初始pH值＜4.0時，發酵環境酸性較高，不利于酵母菌的生長，影響發酵速率，所得果酒的酒精度偏低，酒精度在10.39%vol～11.95%vol之間；當發酵液的初始pH值為4.5時，有利于酵母菌的生長繁殖，果酒發酵更充分，復合果酒的酒精度達到最高值12.50%vol，發酵液殘糖量降到最低5.45 g/L；當發酵液的初始pH值＞4.5時，其他微生物的生長和繁殖增多，進而消耗較多的可發酵性糖，雜菌的生長繁殖還會影響酵母的繁殖和酒精代謝，這時復合果酒的酒精度較低，發酵液殘糖量略有升高[16-17]。初始pH值為4.5、4.0、5.0的酒精度組間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，選擇發酵液初始pH值為4.5。

圖2 不同初始pH值對枇杷-貢梨復合果酒的影響Fig.2 Effect of different initial pH on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.3 不同酵母添加量對枇杷-貢梨復合果酒發酵的影響

由圖3可知，隨著酵母添加量的增加，復合果酒的酒精度呈先上升后下降的趨勢，發酵液的殘糖量不斷降低。當酵母添加量在0.05%～0.20%時，初始酵母數量較低會導致酒精發酵階段酵母數量不足，發酵時間延長，發酵時間結束時，發酵液還殘留較多的可發酵性糖，進而所得復合果酒的酒精度偏低；當酵母的添加量為0.2%時，初始酵母數量較高，在酒精發酵階段酵母菌的數量充足，果酒發酵充分，可發酵性糖的消耗激增，所得復合果酒的酒精度達到最高值12.5%vol；當初始酵母添加量＞0.2%之后，因為酵母的大量生長繁殖，會有較多的糖類用于酵母的生長和繁殖，進而用于酒精代謝的糖類偏少，使得所得復合果酒的酒精度偏低[18]。酵母添加量為0.20%與0.10%、0.30%的酒精度組間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，最優的酵母添加量為0.20%。

圖3 不同酵母添加量對枇杷-貢梨復合果酒發酵的影響Fig.3 Effect of different yeast inoculum on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.4 不同發酵溫度對枇杷-貢梨復合果酒發酵的影響

由圖4可知，當發酵溫度在20～22 ℃時，復合果酒的酒精度偏低而發酵液殘糖含量最高，因為較低的發酵溫度不利于酵母菌的生長和繁殖，酵母的代謝速率隨之減緩，發酵時間隨之延長，復合果酒的酒精度偏低；當發酵溫度為22 ℃時，酵母的生長和繁殖速率最有利酒精的合成，果酒發酵充分，此時復合果酒酒精度最高12.39%vol，發酵液殘糖量最低6.26 g/L；當發酵溫度高于26 ℃之后，酵母菌的生長繁殖速度加快，衰老和死亡速率隨之提高，較高的發酵溫度有利于其他微生物的生長和繁殖，酵母的酒精代謝會受到抑制，因此復合果酒的酒精度低隨之降低[19-20]。發酵溫度為22 ℃與發酵溫度為20 ℃、24 ℃的酒精度組間具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，最適的發酵溫度為22 ℃。

圖4 不同發酵溫度對枇杷-貢梨復合果酒品質的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.5 不同SO2添加量對枇杷-貢梨復合果酒發酵的影響

由圖5可知，復合果酒的酒精度隨SO2添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，發酵液殘糖含量不斷升高。當SO2的添加量＜60 mg/L之前，發酵液中其他微生物的生長不能被徹底抑制，其生長和繁殖不僅會消耗較多的糖還會影響酵母的生長和代謝，導致酒精度的積累量偏低；當SO2添加量為60 mg/L時，酒精度達到最高值，為12.53%vol；當SO2添加量＞60 mg/L之后，對酵母菌的生長繁殖產生抑制作用，復合果酒的酒精度隨之降低，而殘糖量則隨之增加[21]。SO2添加量為60 mg/L的酒精度與其他處理組均具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，SO2的最佳添加量為60 mg/L。

圖5 不同SO2添加量對枇杷-貢梨復合果酒品質的影響Fig.5 Effect of different SO2 addition on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.2 響應面分析試驗優化與結果分析[22]

根據單因素的試驗結果，固定枇杷汁與貢梨汁最佳體積比為1∶2，選擇初始pH值（A）、酵母添加量（B）、發酵溫度（C）和SO2添加量（D）四個因素為自變量，以酒精度（Y）作為響應值，響應面試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface experiments

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3中得到的響應面試驗結果進行多元線性回歸擬合，可以初步得到枇杷-貢梨復合果酒的酒精度（Y）對應發酵工藝條件中初始pH值（A）、發酵溫度（B）、酵母添加量（C）和SO2添加量（D）的回歸方程模型為Y=12.81+0.22A+0.023B+0.071C+0.046D+0.14AB-0.067AC+0.11AD-0.27BC+0.15BD-0.15CD-0.96A2-0.68B2-0.66C2-0.47D2。

由表4可知，該模型P值＜0.000 1，差異極顯著；失擬項的P值為0.786 0＞0.05，所以差異不顯著，可得出試驗所得的模型擬合性較好[23-24]。從模型中各個影響因素的決定系數R2=0.978 3，調整決定系數R2Adj=0.974 4，對于實際試驗中的響應值，該模型能夠做出98.72%的解釋，因此本模型適用于分析和預測枇杷-貢梨復合果酒的發酵工藝條件。一次項A、C，交互項AB、AD對試驗結果影響顯著（P＜0.05）；二次項系數的P值均＜0.001，模型的曲面效應極顯著；交互項BC、BD、CD對試驗結果影響極顯著（P＜0.01）。通過比較F值的大小可以得出，對枇杷-貢梨復合果酒酒精度產生影響順序為初始pH值（A）＞酵母添加量（C）＞SO2添加量（D）＞發酵溫度（B）。

2.2.1 交互作用分析

從響應面圖和等高線的變化趨勢可以反映出各個因素之間的交互作用對枇杷-貢梨復合果酒的酒精度的影響情況。曲面坡度大小來表示各因素對酒精度（響應值）的影響程度，曲面坡度越陡峭表示各因素的交互作用對酒精度的影響程度越大，曲面坡度越平緩則影響程度越小[25-26]。

由圖6可知，初始pH值和發酵溫度交互形成的曲面的坡度較大，說明其對酒精度的影響較大，但等高線圖近似橢圓形說明交互作用較顯著；初始pH值和酵母添加量、初始pH值和SO2添加量兩兩交互形成的曲面的坡度較大，說明其兩兩對酒精度的影響較大，但是等高線圖近似圓形說明兩兩交互作用不顯著；發酵溫度和酵母添加量、發酵溫度和SO2添加量、酵母添加量和SO2添加量因素對酒精度的影響較大且交互作用極顯著。

圖6 初始pH值、二氧化硫添加量、酵母添加量和發酵溫度交互作用對復合果酒酒精度影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH value,SO2 addition,yeast inoculum and fermentation temperature on the alcohol content of compound wine

2.2.2 最佳工藝條件的預測與檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對該模型優化求解得出枇杷-梨復合果酒發酵工藝的最佳參數為：初始pH值為4.56，發酵溫度為22.06 ℃，酵母添加量為0.2%，SO2添加量為61.23 mg/L；模型預測酒精度為12.83%vol。為了便于實際操作，將枇杷-貢梨復合果酒的最優發酵工藝條件修改為枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，SO2的添加量為61 mg/L，發酵溫度為22 ℃，初始pH值為4.6，酵母添加量為0.2%。在此最佳條件下，復合果酒的酒精度為12.67%vol，表明實際值與理論值相差較小，用此模型進行試驗設計和數學模型具有可靠性。

3 結語

通過采用單因素試驗和響應面分析試驗，對枇杷-貢梨復合果酒發酵過程中主要發酵條件的分析，得出對復合果酒影響最大的是酵母添加量，其次是初始pH值和發酵溫度，而SO2添加量的影響最小；枇杷-貢梨復合果酒的最佳發酵工藝條件為：枇杷汁與貢梨汁的體積比1∶2，SO2添加量61 mg/L，發酵溫度22 ℃，初始pH值4.6，酵母添加量0.2%。在此最優發酵條件下，復合果酒的酒精度為12.67%vol，酒體呈淡黃色、澄清透明、果香濃郁、口感醇厚。枇杷-貢梨復合果酒的研制不僅為枇杷和貢梨的深加工藝提供理論依據，還可以豐富果酒市場，推動果酒產業的發展。