丁酸梭菌的生物學(xué)特性分析及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

亓秀曄，張志焱，謝全喜，劉乃芝，郭楊麗，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑省級重點試驗室，山東 泰安 271000）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名宮入菌、酪酸菌、丁酸梭狀芽孢桿菌，屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）梭菌屬（Clostridium），是一種從健康人和動物腸道中分離出的厭氧芽孢桿菌，因其具有產(chǎn)生芽孢的益生功能被廣泛的研究[1]。近年來，丁酸梭菌不斷被分離出來，其益生性能也得到了廣泛認(rèn)可[2-4]。丁酸梭菌代謝產(chǎn)物在促進(jìn)腸道有益微生物增殖、抑制其他有害菌及腐敗菌的生長、減少腸道傳染性病害發(fā)生、提高機(jī)體免疫力等方面起著重要作用[5-7]。尤其是主要產(chǎn)物丁酸是腸道上皮細(xì)胞修復(fù)和再生的主要物質(zhì)，能促進(jìn)畜禽腸道的發(fā)育，強(qiáng)化其各種功能，增強(qiáng)畜禽免疫力和抗病力[8]，為結(jié)腸黏膜細(xì)胞提供主要能量，并為腸道細(xì)胞增殖與成熟提供重要保障等[9]。如菌株ZJU-F1[10]、普拉氏梭桿菌（Fusobacterium prauznitzii）[11]、腸道羅斯拜瑞氏菌（Roseburiaintestinalis）[12]、Butyricicoccuspullicaecorum[13]、菌株C1-6[14]等均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

此外，已有不少學(xué)者研究丁酸梭菌生長的發(fā)酵培養(yǎng)基，但多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)其優(yōu)化培養(yǎng)基或者成分復(fù)雜、提升效果不大或者需要額外加還原劑等。如李雯靜等[15]分離出1株羊源丁酸梭菌HDRyYB1，經(jīng)Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計法和響應(yīng)面法優(yōu)化后，菌株HDRyYB1發(fā)酵完全（18 h）的芽胞數(shù)為1.478×108CFU/mL，是優(yōu)化前的2.7倍；夏會麗等[3]采用響應(yīng)面法對丁酸梭菌HBUT-01的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，確定丁酸的比生成速率、細(xì)胞得率系數(shù)分別比優(yōu)化前降低了20%和提高了132%，說明優(yōu)化后酸脅迫效應(yīng)得到了緩解，細(xì)胞活性得到了有效的維持，使得生物量（14 h）達(dá)到了9.32×108CFU/mL，是優(yōu)化前（4.16×108CFU/mL）的2.24倍；胡曉龍等[16]采用單因素試驗結(jié)合正交試驗優(yōu)化酪丁酸梭菌RL1的發(fā)酵條件，優(yōu)化后該菌株的丁酸產(chǎn)量可達(dá)10.66 g/L，較優(yōu)化前提高了41.76%。

丁酸梭菌在生長過程可形成芽孢，在最終商品化的菌劑中，活菌大都以芽孢的形式存在，條件適宜時可再次萌發(fā)為菌體，從而產(chǎn)生各種益生代謝產(chǎn)物而發(fā)揮作用[17]。本研究從四株丁酸梭菌出發(fā)，通過測定菌株產(chǎn)酸性能、產(chǎn)酶活力、抑菌性能和抗逆性等，篩選生物學(xué)性能最優(yōu)的丁酸梭菌（Clostridium butyricum），并以活菌數(shù)為響應(yīng)值，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。旨在提高該菌株的芽孢數(shù)量，為商品化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

四株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）（BLCC1-0021、BLCC1-0022、BLCC1-0023和BLCC1-0024）：均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

抑菌試驗所用標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）MASA、表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）CMCC（B）26069、宋內(nèi)志賀氏菌（Shigella sonnei）CMCC（B）51592、雞大腸桿菌（Escherichia coli）O1、豬大腸桿菌C249、產(chǎn)毒素大腸桿菌K88、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）C79-20、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、腸炎沙門氏菌ATCC 13076：購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

梭菌增殖培養(yǎng)基[18]：葡萄糖30 g/L，蛋白胨20 g/L，牛肉浸膏15 g/L，CaCO320 g/L，pH 7.0±0.2，118 ℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基中加瓊脂15 g/L。

梭菌計數(shù)培養(yǎng)基[18]：胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照說明書配制，需額外添加0.5%的D-環(huán)絲氨酸溶液。

淀粉瓊脂平板[19]：可溶性淀粉1 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、瓊脂8 g/L，pH 7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min；

纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板[19]：羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na）2 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO41 g/L、剛果紅0.2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖、可溶性淀粉（均為生化試劑）、CaCO3（均為分析純）：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉浸膏、酵母浸膏（均為生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；D-環(huán)絲氨酸（分析純）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚(yáng)州培英實驗儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LABS厭氧培養(yǎng)箱：美國PLAS-LABS；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：上海普元儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 丁酸梭菌發(fā)酵液的制備

接種鏟取丁酸梭菌沙土管1/4鏟于裝有100 mL梭菌增殖培養(yǎng)基的100 mL絲口瓶中，擰緊瓶蓋，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，4 ℃保存待用。

1.3.2 丁酸梭菌菌株生物學(xué)特性比較

將上述活化的四株丁酸梭菌發(fā)酵液分別按照2%（V/V）接種量接種于梭菌增殖培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。分別測定四株丁酸梭菌的產(chǎn)酸性能及發(fā)酵液的活菌數(shù)、芽孢率、抑菌性能、淀粉酶活力、纖維素酶活力、模擬胃液和模擬小腸液存活率。

1.3.3 丁酸梭菌BLCC1-0022培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

前期試驗，以活菌數(shù)為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，最優(yōu)氮源為蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，最優(yōu)無機(jī)鹽為CaCO3、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O。在此基礎(chǔ)上對其培養(yǎng)基成分的含量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

（1）Plackett-Burman（PB）試驗

以活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，選取可溶性淀粉（A）、蛋白胨（B）、牛肉浸膏（C）、酵母浸膏（D）、CaCO3（E）、MgSO4·7H2O（F）、MnSO4·H2O（G）為考察因素。選用N=15的試驗設(shè)計，對7個因素同時進(jìn)行考察，每個獨立變量設(shè)置兩個級別，分別為高水平（+1）和低水平（-1）；設(shè)置3個中心點（5/13/15）。設(shè)計15個梯度，每個梯度2個平行的PB試驗。將上述活化的丁酸梭菌BLCC1-0022發(fā)酵液分別按照2%（V/V）的接種量接種于各分組培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，檢測活菌數(shù)。應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行PB試驗及對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，PB試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett Burman experimental design

（2）最陡爬坡試驗結(jié)果

根據(jù)PB試驗結(jié)果，確定對丁酸梭菌活菌數(shù)具有正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)的因素，根據(jù)線性回歸方程系數(shù)，通過增大正效應(yīng)因素的添加量和減少負(fù)效應(yīng)因素的添加量來提高丁酸梭菌發(fā)酵液活菌數(shù)。設(shè)計10個梯度，每個梯度2個平行的最陡爬坡試驗。

（3）響應(yīng)面試驗

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，設(shè)計4因素、3水平、5個中心試驗點、29組試驗的Box-Benhnken（BB）響應(yīng)面試驗。試驗結(jié)果用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到理論最優(yōu)點。每個組合2個平行。

1.3.4 測定方法

產(chǎn)酸性能[18]：將各發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，采用分光光度法測定發(fā)酵上清液中丁酸和乙酸含量。

抑菌性能：用無菌的0.9%的生理鹽水將各發(fā)酵液菌體濃度稀釋至1×105～1×106CFU/mL范圍內(nèi)，采用牛津杯法（內(nèi)徑6 mm）[11]比較四株菌的抑菌能力，以抑菌圈直徑的大小（mm）表示。試驗時標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液濃度均為100 CFU/mL。

活菌數(shù)[18]：采用稀釋平板計數(shù)法測定發(fā)酵菌液中丁酸梭菌活菌數(shù)。

芽孢率[12]：先將發(fā)酵液按照上述方法進(jìn)行活菌計數(shù)，另取發(fā)酵液于80 ℃水浴處理10 min后再用稀釋平板計數(shù)法測定芽孢數(shù)，重復(fù)3次，計算芽孢率，其計算公式如下：

淀粉酶活力[19]：取相同OD600nm值的1 mL各發(fā)酵液滴加到淀粉瓊脂平板指定位置，厭氧培養(yǎng)24 h，然后在其表面覆蓋一層碘液（5 mmol/L I2和5 mmol/L KI），觀察并測定透明圈的直徑。

纖維素酶活力[19]：取相同OD600nm值的1 mL各發(fā)酵液滴加到纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板的指定位置，厭氧培養(yǎng)24 h，測定透明圈的直徑。

模擬胃液存活率和模擬腸液存活率[20]：人工胃液和人工腸液參照《中國藥典》2015版附錄項下進(jìn)行配制。將培養(yǎng)24 h的丁酸梭菌發(fā)酵液分別接種于人工胃液和人工腸液中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)3 h，重復(fù)3次，測定活菌數(shù)，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌生物學(xué)特性的比較

2.1.1 產(chǎn)酸性能比較

對4株丁酸梭菌產(chǎn)丁酸及乙酸性能比較，結(jié)果見表2。

表2 不同丁酸梭菌菌株產(chǎn)丁酸及乙酸能力比較Table 2 Comparison of butyric acid and acetic acid production capacity of different strains of Clostridium butyricum

由表2可知，發(fā)酵24 h時，菌株BLCC1-0022產(chǎn)丁酸的性能顯著高于菌株BLCC1-0021和BLCC1-0024（P＜0.05），高于菌株BLCC1-0023（P＞0.05）；菌株BLCC1-0022產(chǎn)乙酸性能顯著高于其余菌株（P＜0.05）。結(jié)果表明，菌株BLCC1-0022的產(chǎn)丁酸和乙酸性能最優(yōu)。與文獻(xiàn)中相比較，菌株BLCC1-0022產(chǎn)丁酸的性能還遠(yuǎn)優(yōu)于菌株ZJU-F1[10]（1.87 g/L）、Fusobacterium prauznitzii[11]（1.4 g/L）、Roseburia intestinalis[12]（0.8～1.2 g/L）、Butyricicoccus pullicaecorum[13]（1.1 g/L）和菌株C1-6[14]（2.1 g/L）等。

2.1.2 丁酸梭菌發(fā)酵液抑菌性能比較

4株丁酸梭菌發(fā)酵液對9種指示菌的抑制能力見表3。

表3 不同丁酸梭菌菌株發(fā)酵液的抑菌能力比較Table 3 Comparison of bacteriostatic ability of different strains of Clostridium butyricum

由表3可知，4株丁酸梭菌的發(fā)酵液對9株指示菌均具有抑菌活性。其中菌株BLCC1-0022的抑菌能力最優(yōu)。除產(chǎn)毒素大腸桿菌K88及腸炎沙門氏菌ATCC 13076外，菌株BLCC1-0022對目標(biāo)菌的抑菌性能均高于其他三株菌。這與王倩等[4，21]的研究結(jié)果一致，這可能與丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸、抗菌肽等抑菌物質(zhì)有關(guān)[8，10]。

2.1.3 丁酸梭菌產(chǎn)酶性能和模擬胃腸道耐受性能比較

由表4可知，4株菌的活菌數(shù)和芽孢率差異不顯著（P＞0.05），芽孢率均＞80%，活菌數(shù)最高的為菌株BLCC1-0022；且菌株BLCC1-0022模擬胃液存活率和模擬小腸液存活率較高，都＞95%，優(yōu)于菌株C1-6[14]，說明菌株BLCC1-0022在腸道內(nèi)有較高的耐受性，這與丁酸梭菌在生長后期形成的芽孢有關(guān)[22]。

表4 不同丁酸梭菌菌株的生物學(xué)性能比較Table 4 Comparison of biological properties of different Clostridium butyricum

此外，菌株BLCC1-0022的產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶活力均顯著高于其余菌株（P＜0.05），益生菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生的淀粉酶可以將碳水化合物降解為低聚糖，促進(jìn)益生菌對碳源的利用[23]。綜合來看，丁酸梭菌BLCC1-0022生物學(xué)性能最優(yōu)。

2.2 丁酸梭菌BLCC1-0022培養(yǎng)基組成優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 Plackett-Burman試驗

采用響應(yīng)面法對丁酸梭菌BLCC1-0022的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，效應(yīng)分析見表6。

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Plackett Burman tests

采用一階多項式模型對表5的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的一次線性回歸方程為：

Y=2.50+0.012A+0.031B+0.028C+0.013D+0.025E-0.050F-0.017G

由表6可知，丁酸梭菌BLCC1-0022發(fā)酵液活菌數(shù)響應(yīng)值模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj和決定系數(shù)R2均較高，表明模型擬合程度良好，分析結(jié)果具有一定的可信度。由表6亦可知，不同因素對活菌數(shù)的影響大小排序為蛋白胨＞CaCO3＞牛肉浸膏＞酵母浸膏＞可溶性淀粉＞MgSO4·7H2O＞MnSO4·H2O，且僅蛋白胨對丁酸梭菌BLCC1-0022活菌數(shù)有顯著影響（P＜0.05）。因此，可以考慮將蛋白胨作為主要因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗。其中蛋白胨、CaCO3、牛肉浸膏、酵母浸膏、可溶性淀粉對丁酸梭菌BLCC1-0022活菌數(shù)的影響為正相關(guān)，MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的影響為負(fù)相關(guān)。因此，可以通過增大蛋白胨、可溶性淀粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、CaCO3的添加量和減少MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的添加量來提高丁酸梭菌發(fā)酵液活菌數(shù)，以達(dá)到最大響應(yīng)值。

表6 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素水平及效應(yīng)分析Table 6 Factors,levels and effect analysis of Plackett Burman experimental design

2.2.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

由PB試驗線性回歸方程可知，F(xiàn)和G的系數(shù)分別為0.050和0.017，其比例大概為3∶1，即F每減少3個單位（%）、G減少1個單位（%）；A、B、C、E的系數(shù)分別為0.012、0.031、0.028和0.025，其比例大概為1∶2∶2∶2，即A每增加一個單位（%），B增加2個單位（%），C增加2個單位（%），E增加2個單位（%）。設(shè)計10個梯度，每個梯度2個平行的最陡爬坡試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。

表7 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of steepest climbing tests

由表7可知，第5組丁酸梭菌BLCC1-0022的活菌數(shù)最高，為5.67×108CFU/mL。因此，在后續(xù)的響應(yīng)面分析試驗中以本試驗第5組為中心點進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計分析。

2.2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)PB及最陡爬坡試驗，以活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，選擇影響因素較大的且添加量相對較大的可溶性淀粉（X1）、蛋白胨（X2）、牛肉浸膏（X3）及CaCO3（X4）為考察因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，試驗因素與水平見表8，試驗設(shè)計及結(jié)果見表9，方差分析結(jié)果見表10。

表8 響應(yīng)面試驗因素設(shè)計與水平Table 8 Factors and levels of response surface tests design

對表9的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立活菌數(shù)的回歸模型。回歸方程為Y=71.02+2.61X1+16.88X2+4.75X3+15.62X4-2.18X1X2-1.25X1X3+1.69X1X4+2.80X2X3+3.64X2X4-1.41X3X4-111.24X12-25.99X22-6.03X32-14.32X42。

表9 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 9 Design and results of response surface tests

由表10可知，模型擬合的決定系數(shù)（R2值）和校正決定系數(shù)（R2Adj值）分別為0.916 5和0.832 9，表明模型的擬合程度良好，可信度高。模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項P值為0.973 8，不顯著（P＞0.05），說明該模型可用。

由表10亦可知，各因素對丁酸梭菌活菌數(shù)影響的主次順序為蛋白胨＞CaCO3＞牛肉浸膏＞可溶性淀粉，即蛋白胨和CaCO3的影響最大，其次是牛肉浸膏，最后是可溶性淀粉，這與PB試驗結(jié)果一致。由回歸方程和方差分析還可知，模型中一次項X2和X4、二次項X22和X42對丁酸梭菌活菌數(shù)的影響極顯著（P＜0.01），二次項X12、X32影響顯著（P＜0.05），其他項影響不顯著（P＞0.05）。

表10 回歸模型的方差分析Table 10 Variance analysis of regression model

此模型計算出的可溶性淀粉（X1）、蛋白胨（X2）、牛肉浸膏（X3）、CaCO3（X4）的最優(yōu)添加量分別為2.42%、3.27%、3.31%和2.47%，預(yù)測的響應(yīng)值為6.987×108CFU/mL。為了驗證模型的有效性，采用最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)丁酸梭菌BLCC1-0022得到的活菌數(shù)實際值為6.721×108CFU/mL，芽孢率為98.21%，與預(yù)測值總體吻合，說明模型可靠。且優(yōu)化后的培養(yǎng)基與原始培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基）相比，活菌數(shù)提高了3.22倍，芽孢率提高了17%。與夏會麗等[3，15-16]的研究相比，簡化了培養(yǎng)基組分，顯著提高了性價比，這為下一步丁酸梭菌BLCC1-0022商業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[24-25]。因此，最終確定優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉2.42%、蛋白胨3.27%、牛肉浸膏3.31%、CaCO32.47%、MgSO4·7H2O 0.025%、MnSO4·H2O 0.025%。

3 結(jié)論

本試驗從四株丁酸梭菌出發(fā)，通過測定菌株產(chǎn)酸性能、產(chǎn)酶活力、抑菌性能和抗逆性等，篩選出生物學(xué)性能最優(yōu)的丁酸梭菌BLCC1-0022，并以活菌數(shù)為響應(yīng)值，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面試驗得到其最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：可溶性淀粉2.42%、蛋白胨3.27%、牛肉浸膏3.31%、MgSO4·7H2O 0.025%、MnSO4·H2O 0.025%、CaCO32.47%。在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基下，丁酸梭菌BLCC1-0022活菌數(shù)為6.721×108CFU/mL，芽孢率為98.21%，與原培養(yǎng)基相比，分別提高了3.22倍、17%。