非釀酒酵母菌的分離鑒定及產酯關鍵酶活性的研究

徐曉裕，萬瑞琪，馬延琴，葛正凱，李 甜，王 斌，史學偉*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

不同種的酵母菌株用于葡萄酒的釀制，可能會使葡萄酒產生不同的感官品質[1]。在目前的葡萄酒行業中，非釀酒酵母在葡萄酒中的作用逐漸受到了釀酒師們的重視。因為它不但可以轉換葡萄汁和其他含糖液體中的一部分糖類物質，還能通過自身代謝產生有益于葡萄酒的風味物質，從而提升葡萄酒的感官品質[2]。通常在發酵初始階段，非釀酒酵母菌的生長較為旺盛，會產生一些影響葡萄酒酒體香氣的重要成分。它們使葡萄酒擁有更加復雜的口感和香氣。一般來說，非釀酒酵母菌與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發酵的葡萄酒的酒體香氣等方面都遠遠優于單一釀酒酵母菌發酵的葡萄酒[3-4]。

如果在釀造過程中，葡萄酒中的揮發性成分種類、含量以及平衡關系發生改變，那么酒體最后呈現的香氣也會不同。其中，揮發性物質中最主要的是醇類物質和酯類物質[5]。然而，大部分的醇類物質與刺激性的氣味有關，而酯類物質是葡萄酒中果香味的主要來源[6]。通常將葡萄酒中的酯類物質分為乙酸酯類和乙基酯類。在以往的研究中，關于乙酸酯的研究較多，因為它的生成量比乙基酯多，更易于分析研究[7]。醇類和乙酰輔酶A是醇乙?；D移酶（alco hol acyltransferases，AAT）生成乙酸酯途徑過程中的底物。AAT是一個巰基轉移酶，能將供體上的基團轉移到受體上，而這個供體就是乙酰輔酶A[8]。乙醇和高級醇都可作為AAT的底物[9]。而乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的特異性則決定了醇可用于酯的形成。另外一條途徑是乙酸和相應的醇類在酯酶的作用下合成乙酸酯。該反應是一個可逆反應，即酯酶既可以催化乙酸酯的合成，也可以催化乙酸酯的分解[10]。酯酶的存在形式有兩種，它既可以以單體的形式存在，也可以以低聚物的形式存在。酯酶的主要作用是催化酯類的水解，從而調節葡萄酒中酸與酯的平衡[11]。

酯類物質一般是在ADH、AAT和酯酶的作用下形成的。目前對釀酒酵母的酶學特性研究較為成熟，而對非釀酒酵母中關于酯生成關鍵酶活性的研究鮮見報道。因此，本研究通過從來自新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州瑪納斯中信國安的葡萄表皮分離篩選非釀酒酵母，并對代表菌株進行分子生物學鑒定，最后，分析不同非釀酒酵母產酯含量及體內ADH、AAT和乙酸酯水解酶的活性，有助于分析解釋非釀酒酵母代謝酯類物質的差異性，為以后能更高效率的分離篩選出能產香的非釀酒酵母奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料及菌種

在瑪納斯中信國安的葡萄園中，用五點取樣法在不同葡萄種植地中采取不同品種（克里木波西（K）、巴柯（B）、紅巴克特（HB）、愛費立奧（AF）、希姆勞特（XM）、赫爾松（HE）、曼道萬卡（MD）、赤霞珠（C）、美樂（ML）以及西拉（XL））的葡萄樣品。在采集過程中，要避免人為的污染，將采集的葡萄樣品先裝入無菌的保鮮袋之后再貼標，在24 h以內送往實驗室儲存，4 ℃條件下保存。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sc288：上海杰兔工貿有限公司。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基[12]：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。YPD培養基中添加瓊脂20 g/L。

WL營養瓊脂培養基[13]：葡萄糖50 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，瓊脂20 g/L，氯化鈣1.25 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，氯化鉀4.25 g/L，氯化鐵0.25 g/L，磷酸二氫鉀5.5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，溴甲酚綠0.44 g/L，pH 5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

液體發酵培養基[14]：MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NH4NO33 g/L，吐溫80 10 g/L，KH2PO44 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖2.0 g/L。

1.1.3 試劑

真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京博邁斯生物科技有限公司；5,5'二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5'-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、DL-二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）：上海麥克林生化科技有限公司；乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）：北京索萊寶科技有限公司；5-（6-）羧基熒光素二乙酸酯（5（6）-carboxyfluorescein diacetate，cFDA）：北京索萊寶科技有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、Ladder Marker、DNA擴增引物：上海生工生物技術有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

SPX-250B生化培養箱：常州諾基儀器有限公司；DYY-8CLHP電泳儀：北京六一生物科技有限公司；GelDOCXR凝膠成像系統：美國BioRad公司；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司；B250恒溫水浴鍋：上海予卓儀器有限公司；X7酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

取完整且不同品種的葡萄分別裝于含有150 mL無菌水的錐形瓶中，在28 ℃、150 r/min條件下培養1 d，制成菌懸液[15]。之后取1 mL的菌懸液于9 mL的無菌水試管，搖勻，將其標為10-1稀釋梯度，依次梯度稀釋至10-7。每個梯度分別取100 μL的稀釋菌懸液分別涂布于YPD培養基中，28 ℃條件下培養1 d[16]。將分離出的單菌落平板劃線進行純化。

1.3.2 菌株形態及表型鑒定

將分離純化后的單個菌落接種到WL培養基上，在28 ℃條件下培養5 d，并結合NIKOLAOU E等[17]對酵母菌在WL培養基上的描述，對分離純化的酵母菌進行初步分類。依據WL培養基的初步分類，將挑選出的每個表征形態的菌株在YPD培養基上劃線培養，挑選單菌落進行形態觀察。

1.3.3 代表菌株的分子生物學鑒定

根據真菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取代表菌株的DNA。采用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對菌株進行PCR擴增[18]。PCR擴增體系：酵母菌DNA樣品1μL，正向反向引物各1 μL，SuperMix 25 μL，雙蒸水（ddH2O）補至50 μL，空白不加模板DNA。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共循環35次；72 ℃再延伸3.5 min。將PCR擴增產物點樣至1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海生工測序公司進行測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank核酸序列數據庫中，通過基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對，獲得同源酵母標準菌株的序列后，使用ClustalW程序將菌株序列進行對齊排列，采用軟件MEGA-X中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法建立系統發育樹[19]。

1.3.6 總酯含量的測定

將甘油保藏的菌株，按5%（V/V）的接種量接入10 mL YEPD培養基，28 ℃活化培養2 d；取2.5 mL接入50 mL YEPD培養基，于28 ℃、180 r/min條件下培養2 d；然后取10 mL接入到180 mL液體發酵培養基，于28 ℃、150 r/min條件下培養3 d。采用皂化中和法測定酵母菌的總酯含量[20]。

1.3.7 酶活力的測定

以商品釀酒酵母Sc288為對照，將產酯含量較高的酵母菌接入15 mL YEPD培養基中，于28 ℃、150 r/min條件下培養1 d；將培養后的酵母轉接入200 mL YEPD培養基中，相同條件下培養1 d。取發酵液于8 000 r/min條件下離心15 min，收集細胞，并在磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）中洗滌3次，最后再懸浮在PBS中，采用超聲破碎機破碎細胞13 min。將菌體懸浮液在8 000 r/min條件下離心15 min，吸取上清液作為粗酶液。參照文獻[21]測定ADH酶活力，參照文獻[22-23]測定乙酸酯水解酶活性，參照文獻[24-25]測定AAT酶活力。

1.3.8 數據處理

用MEGA-X軟件建立系統發育樹，在實驗過程中每組實驗平行做3次后取平均值，最終結果以“平均值±標準偏差”表示，同時用Origin 2019b軟件進行實驗圖的繪制，用SPSS 23.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 分離酵母菌的及菌落形態

采用YPD培養基從不同品種的葡萄中共分離出72株酵母菌，編號為K1～K10、B1～B6、HB1～HB6、AF1～AF4、XM1～XM6、HE1～HE6、MD1～MD6、C1～C10、ML1～ML8、XL1～XL10。根據不同種類的酵母菌會在WL培養基上呈現不同的形態，采用WL培養基對酵母菌進行復篩，部分菌株的菌落形態見圖1。

圖1 WL培養基上部分酵母菌的菌落形態特征Fig.1 Colony morphology characteristic of some yeast strains on WL medium

根據菌落在WL培養基上不同的形態特征，按照CAVAZZA A等[17]方法對分離純化的菌株進行分類描述，結果見表1。由表1可知，供試酵母在WL培養基上呈現不同顏色和培養類型，將其初步分為10類。

表1 分離酵母菌的菌落形態描述及分類Table 1 Colony morphology description and classification of isolated yeasts

2.2 分離酵母菌的顯微形態

經過顯微鏡觀察，可將菌株顯微形態分為5類，挑取具有代表性的單菌落，在光學顯微鏡下觀察顯微結構（400×），結果見表2，具體描述及分類結果見圖2。

圖2 代表酵母菌的顯微形態Fig.2 Microscopic morphology of representative yeasts

表2 分離菌株的顯微形態描述及分類Table 2 Microscopic description and classification of isolated yeasts

由圖2和表2可知，通過對分離菌株的細胞顯微觀察，供試菌株呈現圓形、橢圓、棒狀和梭狀，單端芽殖，均符合酵母菌的基本菌落形態特征。

2.3 酵母菌的分子生物學鑒定

從72株分離出的酵母菌株中挑選表型生長活性較好的33株代表菌株，基于26S rDNA D1/D2區域基因序列構建系統發育樹，結果見圖3，鑒定結果見表3。

圖3 基于26S rDNA基因序列33株酵母菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic trees of 33 yeast strains based on 26S rDNA gene sequences

由圖3及表3可知，33株代表菌株被鑒定為11個屬共13個種，包括紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、有孢漢生酵母菌屬（Hanseniaspora）、洛德酵母屬（Lodderomyces）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、棒孢酵母屬（Clavispora）、畢赤酵母屬（Pichia）和鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）。

表3 33株酵母菌株的鑒定結果Table 3 Identification results of 33 yeast strains

2.4 非釀酒酵母種屬占比分析

對不同非釀酒酵母在分離非釀酒酵母菌株所占比例進行分析，結果見圖4。

圖4 不同非釀酒酵母在分離非釀酒酵母菌株中所占的比例Fig.4 Proportion of different non-Saccharomyces cerevisiae in isolated non-Saccharomyces cerevisiae strains

本研究鑒定出31株非釀酒酵母酵母菌，其中Rhodotorula酵母有5株，占比16.13%；Sporidiobolus酵母有3株，占比為9.68%；Cryptococcus酵母有4株，占比12.9%；Torulaspora酵母有2株，占比為6.44%；Kluyveromyces酵母有3株，占比9.68%；Hanseniaspora酵母有5株，占比16.13%；Lodderomyces、Metschnikowia酵母以及Clavispora酵母各僅有1株，分別占比3.23%；Pichia酵母則有6株，占比19.35%。其中，Rhodotorula、Hanseniaspora以及Pichia含量較多，分別占16.13%、16.13%和19.35%，說明這三類酵母屬為此葡萄產地非釀酒種屬中的主要類別。

2.5 酵母菌的總酯產量

33株代表酵母菌以及一株商品釀酒酵母Sc288的總酯含量見表4。

表4 33株代表酵母菌的總酯產量Table 4 Total ester yield of 33 typical yeast strains

由表4可知，33株酵母菌中除菌株XL7、C2、MD5、B6、K2、AF2及C3外，其余菌株的發酵液中均檢測出了酯類物質，且60%的菌株酯類含量差異不顯著（P＞0.05）。不同菌株的總酯含量為1.44～5.22 g/L，其中商品釀酒酵母Sc288的酯類含量為4.04 g/L，選取比商品釀酒酵母Sc288產酯含量高的非釀酒酵母XM2（5.22 g/L）、K3（4.91 g/L）、HE3（4.63 g/L）和ML3（4.57 g/L）進行產酯關鍵酶的活性的研究。

2.6 關鍵酶活性的研究

2.6.1 非釀酒酵母菌株的ADH活性

不同底物的醇類（乙醇、正丁醇、苯乙醇、異戊醇）分別以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）為輔因子進行ADH活性的測定，結果分別見表5和表6。

表5 以NAD為輔因子酵母菌株的乙醇脫氫酶活性Table 5 Activity of alcohol dehydrogenase of yeast strains with NAD as coenzyme U/mL

表6 以NADP為輔因子酵母菌株的乙醇脫氫酶活性Table 6 Activity of alcohol dehydrogenase of yeast strains with NADP as coenzyme U/mL

由表5及表6可知，以NAD為輔因子，乙醇為底物時，商品釀酒酵母Sc288的ADH活性[（2 138.03±326）U/mL]最高，且是以正丁醇為底物時[（179.66±11）U/mL]的11.9倍。以NAD為輔因子，以苯乙醇為底物時，僅有商業釀酒酵母Sc288有ADH活性[（34.26±3）U/mL]，而以異戊醇為底物時，所有菌株均未檢出ADH活性。與使用NAD作為輔因子的情況相比，NADP作為輔因子的ADH活性則更低。

關于菌株XM2，以NAD為輔因子，正丁醇為底物時，ADH活性是以乙醇作底物時的3.23倍，分別為（572.18±40）U/mL和（177.46±21）U/mL。與使用NAD作為輔因子的情況相比，NADP作為輔因子的ADH活性較低。以乙醇為底物時的ADH活性相對較高[（29.10±1.50）U/mL]，而以苯乙醇為底物的ADH活性低于檢測限。關于菌株ML3，以NAD為輔因子，乙醇為底物時，ADH活性是以正丁醇為底物時的1.65倍，分別為（937.45±88）U/mL和（567.87±28）U/mL。而以NADP作為輔因子，乙醇作為底物的酶活低于檢測限度，以苯乙醇作為底物的ADH活性[（34±2.20）U/mL]高于以其他醇作為底物的ADH的活性。關于菌株HE3，以NAD為輔因子，乙醇為底物時，ADH活性是以丁醇作底物時的2.43倍，分別為（504.09±49）U/mL和（207.56±23）U/mL。以NADP作為輔因子的ADH活性在正丁醇、苯乙醇以及異戊醇中均未檢測到，只有在乙醇中檢測到，為（30.30±1.80）U/mL。關于菌株K3，以NAD為輔因子，乙醇為底物的ADH活性是以正丁醇為底物的2.12倍，分別為（1 078.44±126）U/mL和（504.15±40）U/mL。以NADP作為輔因子，正丁醇和異戊醇為底物時，ADH酶活較高，分別為（37.40±2.01）U/mL和（29.13±1.32）U/mL，其次是以乙醇以及苯乙醇，分別為（20.80±1.70）U/mL和（16.34±1.23）U/mL。

綜合表4、表5及表6，未觀察到ADH酶活性與相應的總酯含量之間的相關性。一般來說，ADH的酶活性受到酮酸的生成及其進一步脫羧為醛的限制[26-27]。因此可以預測，酵母菌在發酵培養基中生成的揮發性醇的供應不是酯類物質生產的限制步驟。

2.6.2 非釀酒酵母菌株的乙酸酯水解酶活性

由圖5可知，乙酸酯水解酶活性最高的菌株為非釀酒酵母ML3，為14.3 U/mL，活性最低的是菌株XM2，為5 U/mL。結合表4分析可知，乙酸酯水解酶與酯類含量呈現負相關。值得注意的是，在研究中，乙酸酯水解酶活性是用5（6）-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯（5-（6）-carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，cFDA）法測定的，這為高通量熒光篩選并測定酵母菌株乙酸酯水解酶的活性以及確定酵母菌株生長歷史對這一活性的影響提供了一種選擇。

圖5 酵母菌株乙酸酯酶活性Fig.5 Acetate esterase activity of yeast strains

2.6.3 非釀酒酵母菌株的AAT活性

由圖6可知，AAT活性最高的是菌株XM2，為22.3 U/mL，活性最低的為菌株ML3，為9 U/mL。五種酵母菌的AAT活性從大到小依次為XM2＞K3＞HE3＞Sc288＞ML3。結合表4分析結果可知，AAT水解酶的活性與酵母菌總酯含量呈現出一定的正相關。但有研究表明，AAT的酶活性可能會受到乙酸酯水解酶活性的影響[28]，故酵母菌AAT酶活的測定的方法還需要進一步的優化。

圖6 酵母菌株的醇乙?；D移酶活性Fig.6 Alcohol acyltransferases activity of yeast strains

通過對以上三個酶活性的測定分析，可以看出不同非釀酒酵母ADH酶活的差異性是較為明顯的，且ADH酶的活性與酯的含量沒有發現一定的相關性。以NAD為輔因子的酵母ADH酶的活性整體要高于以NADP為輔因子的ADH酶的活性。菌株ML3和K3的ADH活性均高于其他兩株非釀酒酵母。乙酸酯水解酶活性與酯類含量呈現負相關，AAT酶活性與酯類含量呈現正相關，由此可以推測乙酸酯水解酶以及AAT對酯類物質的生成可能有極大地影響。對比乙酸酯水解酶的活性與AAT酶的活性可以發現，AAT酶的活性普遍比乙酸酯水解酶的活性要高，即推測AAT對酯類物質的生成的作用更明顯。

3 結論

采用傳統培養分離方法從新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州瑪納斯中信國安所選釀酒葡萄表皮篩選得到72株酵母菌，結合形態觀察及WL培養基鑒定，篩選出33株生長表型較好的酵母菌，經分子生物學鑒定，其中31株為非釀酒酵母，歸屬于10個屬，分別為紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、有孢漢生酵母菌屬（Hanseniaspora）、洛德酵母屬（Lodderomyces）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、棒孢酵母屬（Clavispora）、畢赤酵母屬（Pichia）和鎖擲酵母屬（Sporidiobolus），且其中紅酵母屬（16.13%）、有孢漢生酵母菌屬（16.13%）和畢赤酵母屬（19.35%）為此地非釀酒酵母種屬的主要類別。非釀酒酵母中TorulasporaXM2（5.22 g/L）、PichiaK3（4.91 g/L）、HanseniasporaHE3（4.63 g/L）和PichiaML3（4.57 g/L）總酯含量較高。通過對其產酯關鍵酶活性的測定推測乙酸酯水解酶以及AAT對酯類物質的生成可能有極大地影響。本研究為篩選優良的非釀酒酵母提供理論依據，為新疆本地開發具有明顯地域特色的葡萄酒產品的提供幫助。