ERK5對人肺成纖維細胞自噬、凋亡和增殖的調控

華曉敏，王昌明

(桂林醫學院附屬桂林市人民醫院呼吸內科,廣西桂林 541000)

細胞外信號調節激酶5(ERK5)是一種促分裂原活化蛋白激酶，在許多組織中普遍表達，并被多種細胞外刺激信號激活，以調節細胞增殖和分化、細胞存活、抗凋亡信號傳導[1]。ERK5屬于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號家族，其氨基末端激酶結構域具有相對較大的羧基末端，由于此獨特的結構和功能使其與其他MAPK成員區分開[2]。研究表明ERK5作為不同癌癥的靶向因子，抑制ERK5活性或沉默ERK5在癌細胞中具有抗增殖活性，并在動物模型中阻斷腫瘤生長[3]。已有研究發現ERK5抑制劑有緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的作用[4]，但其對減輕肺纖維化的機制尚未有充足的研究。本研究通過細胞實驗探討ERK5對成纖維細胞增殖、凋亡和自噬的調控及對成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的影響，為研究肺纖維化的發生機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人肺成纖維樣細胞系(HLFs)，細胞編號KCB200695，來源于中國科學院昆明細胞庫。細胞培養箱條件：5% CO2、37 ℃培養箱。完全培養基：DMEM高糖培養基+10%胎牛血清(美國Gibco公司)+0.5%青霉素-鏈霉素混合液。

1.2 主要實驗試劑

Recombinant Human轉化生長因子β1(TGF-β1)2 μg粉劑(美國PeproTech公司)，用含海藻糖溶液溶解至10 μg/mL，分裝后于-80 ℃儲存。Vector-flag空載體、ERK5-flag(吉瑪基因)各50 μg干粉分別經短暫高速離心后溶于50 μL ddH2O，溶解為1 μg/μL的儲存液，分裝后于-20 ℃儲存。DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(Gibco FBS-10099-141，美國Gibco公司)，1%青霉素及鏈霉素(美國Gibco公司)，0.25%含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶(美國Gibco公司)。α-SMA、Fibronectin、Bcl-2、Cleaved-Caspase3和增殖細胞核抗原(PCNA)一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記過的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。細胞增殖/毒性檢測(CCK8)試劑盒(美國MCE公司)。細胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗分組

(1)建立肺纖維化細胞模型：NC組、TGF-β1組。(2)檢測細胞增殖、凋亡：vector組、ERK5組、vector+TGF-β1組、ERK5+TGF-β1組。(3)檢測細胞自噬：vector組、ERK5組、 ERK5+TGF-β1組、vector+TGF-β1組、ERK5+TGF-β1+Rapamycin組、Rapamycin對照組。

1.3.2Western blot

建立濃度為10 ng/mL的TGF-β1作用24 h誘導HLFs肺纖維化模型，采用Western blot檢測各組細胞表型轉化標志性蛋白Fibronectin、α-SMA的表達水平；HLFs經過轉染過表達ERK5基因的質粒(ERK5)48 h后，再用TGF-β1處理，采用Western blot分別檢測各組自噬相關蛋白P62、Beclin-1和LC3Ⅱ的表達水平，凋亡相關因子Cleaved-Caspase-3和Bcl-2的蛋白表達水平，PCNA的表達水平。細胞培養完成后，經RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，蛋白定量采用BCA試劑盒定量方法，制備等質量上樣蛋白樣品，經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后使蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉和孵育抗體后，在暗室中壓片，將膠片掃描到電腦后進行條帶灰度值量化分析。

1.3.3CCK8檢測細胞增殖

HLFs在96孔板中培養24 h，每組設置6個復孔，經過TGF-β1處理24 h、轉染48 h后加入用完全培養基稀釋10倍的CCK8試劑，設置3個空白對照組，加入CCK8試劑后孵育4 h后，用多功能酶標儀檢測吸光度(A)值，波長取460 nm。計算：細胞增殖率(%)=[實驗組A值-空白對照組A值]/[NC組A值-空白對照組A值]。

1.4 統計學處理

應用SPSS20.0軟件進行數據統計學分析。用單因素方差分析，先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布、方差齊者兩兩比較采用S-N-K法分析，方差不齊者采用Dunnett′st3檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HLFs中Fibronectin和α-SMA的表達

TGF-β1處理后，Western blot檢測結果顯示TGF-β1組中Fibronectin和α-SMA蛋白相對表達較NC組明顯增加，見圖1。

圖1 Western blot檢測HLFs中Fibronectin和α-SMA的表達

2.2 過表達ERK5促進HLFs中α-SMA的表達

Western blot檢測結果顯示：過表達ERK5組ERK5表達水平較vector組明顯增加(圖2)。過表達ERK5后，TGF-β1處理細胞24 h，Western blot檢測α-SMA蛋白相對表達水平。結果顯示：與vector+TGF-β1組相比，ERK5+TGF-β1組α-SMA蛋白相對表達水平增加(圖3)。

圖2 Western blot檢測過表達ERK5效果

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。

2.3 過表達ERK5促進HLFs增殖

過表達ERK5基因后，TGF-β1處理細胞24 h，Western blot檢測PCNA的表達，CCK8檢測細胞增殖率。結果顯示：與vector+TGF-β1 組相比，ERK5+TGF-β1組PCNA相對表達水平，見圖4；vector+TGF-β1組較vector組細胞增值能力增強，ERK5+TGF-β1組較vector+TGF-β1 組細胞增殖能力增強，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。a:P<0.05。

2.4 過表達ERK5抑制HLFs凋亡

過表達ERK5基因后，TGF-β1處理細胞24 h，Western blot檢測Bcl-2和Cleaved-Caspase-3的表達。與vector+TGF-β1組比較，ERK5+TGF-β1組Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達水平降低，Bcl-2蛋白增加，見圖6。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組。

2.5 過表達ERK5抑制HLFs自噬

ERK5+TGF-β1組較vector+TGF-β1組P62蛋白相對表達水平增加，LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平降低，表明細胞自噬受到抑制；α-SMA蛋白相對表達水平增加，表明細胞表型轉化增加。應用自噬激活劑后的ERK5+TGF-β1+Rapamycin組較ERK5+TGF-β1組α-SMA、P62蛋白相對表達水平均降低，LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平增加，表明自噬受到激活后抑制了細胞表型轉化，見圖7。

A：vector組；B：vector+TGF-β1組；C：ERK5組；D：ERK5+TGF-β1組；E：ERK5+TGF-β1+Rapamycin組；F：Rapamycin對照組。

3 討 論

肺纖維化是一種以持續上皮細胞損傷和過量細胞外基質沉積為主要病理特征的慢性纖維增生性疾病。在疾病的發展過程中，成纖維細胞向肌成纖維細胞(MF)的轉化，進而分泌膠原、促進細胞外基質的沉積[5]。TGF-β1是致肺纖維化關鍵性的細胞因子，其在促進肺成纖維細胞的表型轉化和細胞外基質沉積過程發揮著重要作用。已有研究表明在肺纖維化中 TGF-β1 mRNA 水平高表達[6]。Fibronectin、α-SMA、Collagen-Ⅰ等是成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的標志因子，在肌成纖維細胞中，此類因子的表達水平明顯高于在成纖維細胞[7]。在本研究中，以Fibronectin和α-SMA的蛋白表達水平反映HLFs向肌成纖維細胞的表型轉化情況。經TGF-β1處理HLFs后，Western blot檢測結果顯示α-SMA和Fibronectin的蛋白表達水平明顯增加，證明實驗中TGF-β1成功誘導HLFs的表型轉化。過表達ERK5后，Western blot檢測結果顯示α-SMA蛋白表達量增加，說明ERK5可促進TGF-β1誘導的HLFs表型轉化過程。

體內細胞增殖的測量通常通過檢查靜態方法來進行，比如檢測標記物指數，包括DNA合成標記物如溴脫氧尿苷，或固有標記物如Ki67和增殖細胞核抗原(PCNA)[8]。PCNA是存在于真核細胞核中的一種多功能蛋白質，它作為DNA復制和修復的組成部分發揮重要作用[9]。通過Western blot檢測PCNA的表達水平，結果表明過表達ERK5 后，PCNA表達水平升高，CCK8細胞增殖檢測到過表達ERK5后細胞增殖率上升，說明ERK5促進HLFs增殖。但在HLFs表型轉化過程中，ERK5調控細胞增殖的分子機制及其與在表型轉化中發揮的作用需要進一步探討。

細胞凋亡是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下通過細胞內基因及其產物的調控而發生的程序性細胞死亡過程[10]。細胞凋亡被認為是各種過程的重要組成部分，細胞凋亡對組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用[11]。非正常的細胞凋亡(太少或太多)是許多人類疾病的一個重要因素，包括自身免疫性疾病和許多類型的癌癥。Bcl-2是凋亡調節蛋白家族的創始成員，破壞Bcl-2會導致細胞死亡，抗凋亡的Bcl-2被歸為致癌基因，研究表明Bcl-2基因的損傷會引起多種癌癥，包括淋巴瘤等[12]。Caspase-3是一種凋亡效應類蛋白，Caspase-3的活化(Cleaved-Caspase-3即Caspase-3的活化形式)可直接促使細胞發生凋亡，因此，檢測Cleaved-Caspase-3的蛋白表達水平可直觀地反映HLFs凋亡情況。而Bcl-2的過度表達可抑制Caspase-3的活化，阻斷凋亡進程[13]。所以Bcl-2的表達水平，可在一定程度上反映細胞凋亡抑制情況。在本研究中，過表達ERK5后，Cleaved-Caspase-3的蛋白表達水平明顯降低，而Bcl-2的蛋白表達水平增加，說明在TGF-β1誘導的細胞表型轉化過程中，ERK5起到抑制凋亡的作用。

細胞自噬導致真核細胞內一部分受損、多余的或老化的細胞器及大分子蛋白質被吞噬和降解，從而更利于細胞的存活，該過程的功能障礙導致許多疾病的發生[14]。Beclin-1、LC3、P62是目前研究相對較成熟的自噬相關蛋白。Beclin-1介導細胞自噬起始過程，在啟動階段發揮了重要作用，研究表明在哺乳動物中Beclin-1的過表達可刺激自噬[15]；LC3是自噬標志物，自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)酶解掉一小段多肽，轉變為膜型LC3(即LC3-Ⅱ)，LC3Ⅱ參與自噬溶酶體的形成，所以LC3-Ⅱ的蛋白表達水平可反映細胞自噬水平的高低[16]；P62 可作為將要被自噬作用降解的小泡的受體，在自噬形成的過程中不斷被消耗，所以其表達水平可間接反映細胞自噬情況[17]。在TGF-β1誘導HLFs表型轉化過程中，過表達ERK5后，Western blot檢測結果顯示LC3Ⅱ與Beclin-1的表達水平降低，P62表達水平升高，說明ERK5抑制HLFs自噬；過表達ERK5后，表型轉化的標志性蛋白α-SMA表達水平升高，說明ERK5參與了TGF-β1誘導的細胞表型轉化。應用自噬激活劑后，與未激活自噬組相比，α-SMA組的表達水平下降，說明ERK5有可能通過抑制自噬來促進α-SMA的表達。這為進一步研究ERK5、自噬、肺成纖維細胞表型轉化過程的相互關系提供了一定的基礎依據，但細胞自噬是一個復雜的動態過程，若要明確ERK5是否通過在細胞自噬過程中發揮作用，進而影響表型轉化過程，需要更深入的研究。