6-甲基香豆素對乙型肝炎病毒轉錄和復制的影響*

齊曉婭，鐘 珊，王 晴，白瑞雪，陳 曜△

[1.重慶醫科大學附屬第二醫院健康管理(體檢)中心 400010；2.重慶醫科大學附屬第二醫院感染病科 400010；3.重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室 400010]

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科家族中的一員，其感染已經成為嚴重的公共衛生問題。據統計，全球約3.5億人為HBV慢性感染者，每年約有78.6萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌等嚴重疾病[1]。目前被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于慢性乙型肝炎(CHB)治療的藥物為干擾素α(IFN-α)及5種核苷(酸)類似物。IFN-α可以通過免疫調節發揮其抗病毒作用[2]，但因其應答率低，不良反應明顯且價格昂貴等缺點，使用范圍受到限制[3]。核苷(酸)類似物作為首選的抗病毒治療藥物，具有較強地抑制病毒DNA的能力[2]。但是核苷(酸)類似物需長期服藥，可能導致HBV聚合酶變異而引起耐藥，限制了其發展[4]。目前，現有的藥物均不能有效且全面地抑制HBV復制和HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)的形成。因此迫切需要研發具有全新作用機制和作用靶點的抗HBV藥物來解決這一問題。

香豆素類化合物是廣泛存在于自然界的一類芳香族化合物，分布于許多花草植物中。研究表明，香豆素類化合物具有多種生物學活性，如:抗艾滋病[4]、抗癌[5]、抗炎、抗凝血等。有文獻報道，多種香豆素類化合物在保肝、護肝及抑制HBV感染中起重要作用。7,8-二羥基-6-甲氧基香豆素是從秦皮中提取的天然產物，具有顯著的肝保護和抗纖維化作用[6]。扶芳藤中分離出的香豆素類化合物七葉亭(esculetin)在體內外均可有效抑制HBV復制[7]。龍葵提取物香豆素(東莨菪內酯)和酰胺[N-(對-反-香豆酰基)]酪胺對HBV感染的肝癌細胞中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌有阻斷作用，說明香豆素類化合物生物堿具有抗HBV活性[8]。6-甲基香豆素(6-Methylcoumarin)屬于香豆素類化合物，常作為香料或添加劑，在化妝品、殺蚜劑、煙用添加劑等領域使用。隨著研究的深入，6-甲基香豆素在醫療領域的潛在價值被發現。6-甲基香豆素作為光敏劑，是人和豚鼠光敏性接觸性皮炎的重要誘因，紫外線在此過程中起催化作用[9]。同時，6-甲基香豆素可以作為模板分子參與分子印跡聚合物微球與共聚微球的制備[10]。更重要的是，6-甲基香豆素在抑制細胞生長及抗癌方面發揮了重要作用。有文獻報道馬纓丹鮮葉水提物中的6-甲基香豆素是抑制水葫蘆生長的重要化合物[11]。6-甲基香豆素對人食管癌Ec-109細胞的增殖和遷移有抑制作用，且其聯合紫杉醇后，抑制作用更為顯著[12]。然而，6-甲基香豆素在HBV感染中的作用尚未有研究報道。

本研究采用HBV穩定表達細胞系HepG2.2.15細胞和HBV感染細胞模型HepG2-NTCP細胞及HBV轉基因小鼠模型，研究6-甲基香豆素在HBV轉錄和復制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.2.15細胞購自美國ATCC公司；HepG2-NTCP細胞由重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室保存；胎牛血清，DMEM 高糖型培養基購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素購自美國Hyclone公司；6-甲基香豆素購自美國Sigma公司；MTT試劑購自中國生工生物公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、血清病毒基因組DNA提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購自中國天根生化科技公司；SYBR GREEN購自美國Bio-Rad公司；ELISA檢測試劑盒[HBsAg和乙型肝炎e抗原(HBeAg)]購自上海科華生物工程股份有限公司；SPF級HBV轉基因小鼠(C57BL/6)，雄性，體重(17±2)g，6～8周齡，由廈門大學提供；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

HepG2.2.15細胞培養于含10%胎牛血清、400 μg/mL G418的DMEM培養基中，HepG2-NTCP細胞培養于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中。以上細胞均在含5% CO2、37 ℃的孵箱中培養。分別設置陰性對照組、實驗組和陽性對照組，分別采用含0.1% DMSO的生理鹽水(陰性對照組)，不同濃度的6-甲基香豆素(5、10、20 μmol/L，實驗組)和采用25 nmol/L的恩替卡韋(陽性對照組)進行處理，6 d后檢測HBV相關指標。

1.2.2HepG2-NTCP細胞感染HBV

取2.5×105個/孔的HepG2-NTCP細胞接種于12孔板中。培養1 d后，換為感染培養基。感染培養基處理1 d后，進行感染，感染復數為1 000。感染后1 d，PBS清洗細胞3次，洗去殘留病毒顆粒，并進行藥物處理。

1.2.3動物實驗

HBV轉基因小鼠飼養于SPF級環境。選取15只體重及HBV DNA拷貝數相近的雄性小鼠分為對照組(0.1% DMSO的生理鹽水組)，實驗組(6-甲基香豆素組)和恩替卡韋(ETV)組(陽性對照組)，每組5只。3組分別為6-甲基香豆素溶于DMSO，并用生理鹽水稀釋1 000倍。通過預實驗確定實驗組(6-甲基香豆素組)給藥劑量為5 mg，陽性對照組(ETV組)給藥劑量為0.02 mg，陰性對照組注射含0.1% DMSO的生理鹽水，采用腹腔注射的方式給藥，每2天給藥1次，每6天采血及稱重1次。24 d后處死小鼠，解剖并收集肝臟。

1.2.4MTT法檢測6-甲基香豆素的細胞毒性

將2×104個/孔的HepG2.2.15細胞和HepG2-NTCP細胞接種于96孔板，培養1 d后，加入不同濃度的6-甲基香豆素(倍比稀釋，從200 μmol/L至1.56 μmol/L)處理，每3 天更換1次含藥培養基。6 d后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，避光培養4 h。去除上清液，每孔加入100 μL DMSO充分溶解，酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5RT-qPCR檢測HBV RNA表達水平

使用TRIzol法提取細胞和小鼠肝臟組織的總RNA，取1 μg總RNA進行反轉錄，得到cDNA。RT-qPCR檢測HBV RNA的表達水平，β-actin為內參。HBV RNA上游引物序列為5′-ACC GAC CTT GAG GCA TAC TT-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-GCC TAC AGC CTC CTA GTA CA-3′；內參 β -actin上游引物序列為 5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。實驗設置3個復孔并重復3次。

1.2.6RT-qPCR檢測HBV DNA表達水平

0.5 mL裂解緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、1% NP-40和2% sucrose]于37 ℃裂解細胞15 min，離心去除細胞碎片；加入5 μL的1 mol/L MgCl2和4 μL的 1×105U/L DNase Ⅰ，37 ℃孵育4 h；加入200 μL 35% PEG-8000，冰浴1 h；4 ℃ 12 000×g離心5 min，棄上清液；加入500 μL蛋白酶K消化液[0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol /L Tris-HCl (pH 8.0)和10 mmol /L EDTA]和終濃度為500 mg/L的蛋白酶K，45 ℃孵育過夜后進行酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，最后使用ddH2O溶解HBV DNA。

小鼠血清HBV DNA提取按照血清病毒基因組DNA提取試劑盒說明書進行；小鼠肝臟組織HBV DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行。細胞中HBV DNA的上游引物序列為5′-CCT AGT AGT CAG TTA TGT CAA C-3′，下游引物序列為 5′-TCT ATA AGC TGG AGG AGT GCG A-3′；小鼠血清和肝臟組織中HBV DNA的上游引物序列為5′- CCT CTT CAT CCT GCT GCT-3′，下游引物序列為5′-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3′。實驗設置3個復孔并重復3次。

1.2.7ELISA檢測HBsAg和HBeAg表達水平

ELISA試劑盒檢測細胞上清液和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達水平。藥物處理后，在指定時間收集細胞上清液和小鼠血清，按照說明書進行檢測，用酶標儀測定450 nm處A值。

1.2.8酶標法檢測血清AST和ALT

小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平采用酶標法(賴氏法)檢測。試劑盒購自江蘇建成生物工程研究所，ALT檢測試劑盒(貨號：C009-2)和AST檢測試劑盒(貨號：C010-2)。將全血標本1 000 r/min離心10 min，分離血清；血清樣品與基質緩沖液在37 ℃下混合30 min；然后加入顯色液2，4-二硝基苯肼在37 ℃孵育20 min；隨后加入終止液0.4 mol/L NaOH，室溫靜置5 min，酶標儀測定510 nm處A值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 6-甲基香豆素對細胞活性的影響

6-甲基香豆素在HepG2.2.15和HepG2-NTCP細胞中的CC50>200 μmol/L，見圖1。

2.2 6-甲基香豆素對HepG2.2.15細胞中HBV轉錄和復制的影響

6-甲基香豆素呈濃度依賴性地抑制HepG2.2.15細胞中HBV DNA和HBV RNA的水平，20 μmol/L濃度的6-甲基香豆素對HBV DNA和HBV RNA的抑制率分別為48.33%(圖2A)和58.87%(圖2B)；ETV能夠顯著抑制HBV DNA水平，但對HBV RNA無明顯影響。6-甲基香豆素呈濃度依賴性地降低HepG2.2.15細胞培養上清液中HBsAg和HBeAg的水平，20 μmol/L濃度的6-甲基香豆素對HBsAg和HBeAg的抑制率分別為38.33% (圖2C)和31.67% (圖2D)；ETV組HBsAg和HBeAg水平變化差異無統計學意義。

2.3 6-甲基香豆素對HepG2-NTCP細胞中HBV轉錄和復制的影響

6-甲基香豆素能夠顯著抑制細胞中HBV DNA和HBV RNA的表達，20 μmol/L的6-甲基香豆素對HBV DNA和HBV RNA的抑制率分別為41.67%和45.33%；ETV同樣能夠顯著抑制HBV DNA水平，而對HBV RNA無明顯影響。同時，ELISA實驗證實，6-甲基香豆素可有效降低HepG2-NTCP細胞上清液中HBsAg和HBeAg的表達水平，20 μmol/L的6-甲基香豆素對HBsAg和HBeAg的抑制率分別為29.67%和37.00%；ETV組HBsAg和HBeAg的水平無明顯變化，見圖3。

2.4 6-甲基香豆素對HBV轉基因小鼠的抗病毒效能

3組小鼠體重未出現異常的增高或降低(圖4A)，ALT、AST均無明顯變化(圖4B、C)。與對照組相比，試驗組小鼠血清中HBV DNA的拷貝數減少，且抑制效果隨著時間的延長而增強；ETV組小鼠血清中的HBV DNA拷貝數降低(圖4D)。與對照組相比，試驗組血清中HBsAg和HBeAg的水平持續降低，抑制率分別為51.80%和42.80%，而ETV組HBsAg和HBeAg水平變化不明顯(圖4E、F)。與對照組相比，試驗組和ETV組肝臟組織HBV DNA均被明顯抑制(圖4G)，試驗組對HBV RNA的抑制率為49.80%，而ETV組HBV RNA水平無明顯變化(圖4H)。

A：HepG2.2.15細胞；B：HepG2-NTCP細胞。

A、B：RT-PCR檢測HBV DNA和HBV RNA的表達水平；C、D：ELISA檢測細胞上清液中HBsAg and HBeAg的表達水平。

A、B：RT-PCR檢測HBV DNA和HBV RNA的表達水平；C、D：ELISA檢測細胞上清液中HBsAg and HBeAg的表達水平。

A：時間-體重曲線評估毒性作用；B、C：血清AST、ALT水平；D：RT-PCR檢測小鼠血清中HBV DNA的表達水平；E、F：ELISA檢測小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達水平；G、H：RT-PCR檢測小鼠肝臟組織中HBV DNA和HBV RNA的表達水平。

3 討 論

在HBV生活周期中，HBV病毒顆粒通過NTCP受體內化入胞，脫去衣殼生成rcDNA，rcDNA進一步被修復形成HBV復制模板即HBV的cccDNA，cccDNA轉錄生成4種不同大小的HBV RNAs，其中3.5 kb RNA可作為模板逆轉錄形成HBV DNA[13]。為開發新型的抗HBV藥物，需要選擇真實反映體內HBV生活周期且操作簡易的HBV復制細胞模型和動物模型。本研究結果顯示，6-甲基香豆素可呈濃度依賴性的抑制HepG2.2.15細胞和HepG2-NTCP細胞中HBV DNA和HBV RNA的表達水平，同時可以降低細胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。表明6-甲基香豆素在體外可顯著抑制HBV生活周期中的轉錄和復制過程。隨后，在HBV轉基因小鼠中對6-甲基香豆素的抗HBV效能進行驗證。結果顯示，6-甲基香豆素可以顯著抑制小鼠血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg，以及小鼠肝臟組織中HBV DNA和HBV RNA的表達水平，且呈時間依賴性。這些結果充分證實6-甲基香豆素在HBV轉錄和復制中發揮了重要的負向調節作用，表明6-甲基香豆素具有良好的治療HBV感染的應用前景。

由于香豆素類化合物具有分子量小，合成簡單，生物利用度高，藥理作用廣泛，毒性小等特點，近年來已經成為許多藥物研發工作的研究重點。有相當數量的香豆素類化合物被報道具有抗HBV活性，且機制各不相同。扶芳藤中分離出的香豆素類化合物七葉亭，以劑量依賴的方式抑制HBx蛋白的表達，在體內外均可有效抑制HBV復制[7]。龍須草提取物6-羥基-7-甲氧基-香豆素在無細胞毒性的條件下顯示中等抗HBV活性，降低HBsAg和HBeAg水平，但6，7二甲氧基-香豆素沒有顯示抗HBV活性。從構效關系的角度來看，C6羥基的甲基化降低或消除了抗HBV活性，說明C6羥基在香豆素的抗HBV活性中起重要作用[14]。雙香豆素為天然香豆素的衍生物之一，具有較強的抗HBV效應。雙香豆素可以降低細胞內HBV RNA、HBV DNA，甚至能降低HBV感染細胞中cccDNA的水平，但不影響HBV的吸附/進入[15]。目前6-甲基香豆素的研究報道較少，作用機制尚未明確。本研究顯示6-甲基香豆素在HBV轉錄和復制中發揮了重要的負向調節作用，且6-甲基香豆素對HBV RNA的抑制作用更為明顯。