煙梗纖維素降解菌株HF-09的分離鑒定和降解特性

吳長偉，弓新國，張 勃，李 仙，鄭 琳

（常德華馥生物技術有限公司，湖南 常德 415900）

纖維素、半纖維素、木質素和果膠等細胞壁物質是煙梗的主要組成部分，其在卷煙燃燒熱解過程中產生較多低級醛類，增加了卷煙木質氣和刺激性，降低了煙草感官抽吸質量［1，2］。微生物降解木質纖維素的研究主要集中在真菌（青霉、漆斑霉、脈胞霉、白腐霉、里氏木霉、曲霉等）和細菌（纖維單胞菌、假單胞菌、芽孢桿菌等）［3-7］。然而，細菌以其適應性強，分泌的酶通常具有更好的熱穩定性以及更廣的pH耐受范圍的特性，越來越受到人們的重視［8-12］。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是芽孢桿菌屬的一個新種，具有促進植物生長和抗病蟲害的作用［13-16］。目前，利用貝萊斯芽孢桿菌降解木質纖維素的研究較少。Chen等［13］從杜仲樹皮內分離一株芽孢桿菌157，經16SrRNA分子生物學鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，對秸稈和豆粕混合物進行固態發酵，纖維素降解率為9.06%，半纖維素降解率為43.61%。崔家榮等［17］從牲畜糞便中分離篩選出對檸條木質素具有降解作用的菌株D-11，經微生物形態學和16SrDNA鑒定為地衣芽孢桿菌（Baclicuslincheniformis），該菌株對檸條木質素降解率為18.21%，半纖維素降解率為16.11%，纖維素降解率為13.19%。然而利用細菌降解煙草木質纖維素的研究較少，尤其是貝萊斯芽孢桿菌降解煙梗木質纖維素的研究少見報道。為此，從煙草栽培土壤中分離1株高效降解煙草細胞壁物質的細菌HF-09，通過形態學觀察結合16SrRNA測序和系統進化分析對該菌株鑒定，并研究HF-09降解煙梗細胞壁物質的特性。

1 材料與方法

1.1 樣品和培養基

樣品：煙葉來源于云南昆明紅云紅河集團，品種為紅大，等級為C3F；土壤來源于昆明市附近煙田。

培養基：①LB液體培養基［10］。蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L，pH 7.0；②纖維素酶篩選培養基［8，11］。羧甲基纖維素鈉10 g/L、酵母提取物3 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0；③木質素過氧化物酶篩選培養基［8，11］。1%的苯胺藍母液，過濾除菌，以1%的濃度添加到LB培養基中，制備LB平板；④產酶發酵培養基［8，11］。羧甲基纖維素鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器設備

KDM型調溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；PX223ZH/E型精密電子秤［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；UV-9100型紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；BHS-6電熱恒溫水浴鍋（群安實驗儀器有限公司）；SKY-211B大容量恒溫培養搖床（上海蘇坤實業有限公司）；RE-5250型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀表廠）；同時蒸餾提取器（上海楚柏實驗室設備有限公司）；6890N/5973N氣相色譜/質譜聯用儀（GC/MS，美國安捷倫科技公司）。

1.3 纖維素降解菌株的分離和純化

稱取采集的土壤樣品，加入適量的滅菌生理鹽水，充分振蕩，置于恒溫水浴鍋中（75℃）處理30 min。用10倍連續稀釋法進行稀釋（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），菌懸液分別在LB固體培養基平板上劃平板，37℃靜止培養，3次重復。

將純化菌株接種于纖維素酶篩選培養基平板，于37℃培養12～36 h，染色（剛果紅）30 min，再用1 mol/L的NaCl溶液脫色30 min，測量透明圈直徑與菌落直徑的比值（SI）。

1.4 酶活性檢測

以檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 5.5）作為溶劑，配制CMC-Na底物（1%）溶液。取100μL粗酶液與200μL底物混合，充分振蕩后，50℃水浴30 min，之后加入400μL DNS溶液（3，5-二硝基水楊酸）終止反應，煮沸10 min，自然冷卻，加入2 mL去離子水，充分混勻，取300μL至酶標板，用酶標儀測定540 nm下吸光度。

1.5 纖維素降解菌株的鑒定

1.5.1 形態觀察及生理生化試驗 對分離得到的菌株進行革蘭氏染色和形態學觀察。生理生化試驗參照文獻［18］的方法。

1.5.2 16SrRNA序列擴增和系統進化分析 提取細菌基因組后，用通用引物［19］（16S上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行基因擴增。取2μL PCR反應產物進行凝膠電泳檢測，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對產物進行回收。并通過NCBIBlast比對，從Genbank數據庫中下載親緣關系較近的菌株基因序列，測序結果經Clustal W軟件比對分析，并構建Neighbor-jioning進化樹［13］。

1.6 煙梗纖維素降解試驗

1.6.1 HF-09菌株生物學特性分析

1）生長曲線。將BacillusvelezensisHF-09在LB固體培養基上過夜培養，調整菌液濃度，轉接至100 mL液體LB培養基中（接種量1%），測定菌液最初吸光度（OD600nm），于180 r/min、37℃搖床培養，每間隔1 h取樣，測定OD600nm（重復3次），然后繪制生長曲線。

2）耐受試驗［8］。①溫度耐受。HF-09菌株培養于LB液體培養基，37℃、180 r/min培養12 h，75℃水浴20 min，即為芽孢體（洗滌菌3次），取1 mL菌液到EP管中，置于不同溫度的水浴中處理20 min，自然冷卻至常溫，以芽孢體為對照樣；②pH耐受性。HF-09芽孢體制備同上述方法，取1 mL菌液到EP管中，接種到不同pH的緩沖液（pH 2～12）中，37℃水浴處理3 h。存活率=（處理后的細菌數/處理前的細菌數）×100%。

1.6.2 煙梗木質纖維素降解效果評價

1）木質纖維素含量檢測。經HF-09固態發酵10 d（接總量：1%；種子菌液OD600nm=2.0）的降解煙梗（C3F）送至云南同創檢測技術有限公司進行檢測。采用聚酯纖維濾網袋法測得纖維素、半纖維素、木質素的含量，計算其降解率。降解率［8］（DR）=（接種前某成分含量-接種后某成分含量）/接種前某成分含量×100%。

2）掃描電鏡觀察。將紅大（C3F）煙梗經HF-09固態發酵10 d的降解產物于50℃條件下烘干至恒重，采用掃描電鏡對其表面結構進行觀察。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌株的分離和純化

通過培養基的富集、分離及篩選，得到12株具有降解木質纖維素的菌株，通過對其SI、羧甲基纖維素酶（CM Case）和濾紙纖維素酶（FPAse）檢測分析，12株菌SI均大于3，其中HF-09菌株CMCase和FPAse的酶活性最高，其降解木質纖維素的能力最強（圖1）。為此，選擇HF-09為出發菌株進行研究。

對HF-09菌株進行菌落形態特征、芽孢染色法、革蘭氏染色法鑒定（圖2）。該菌株為短桿菌，乳白色，菌落表面不規則，革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，有運動性。

圖2 菌株HF-09的菌落形態（a）和菌體的革蘭氏染色顯微照片（b）（放大1 000倍）

2.2 16S rRNA序列分析與系統進化樹構建

菌株HF-09的16SrRNA基因擴增序列全長為1 424 bp。同源性序列分析表明，HF-09的16SrRNA序列與GenBank數據庫中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）的同源性達93%～99%，且與已報道的Bacillus velezensis157（KY630544）和Bacillus velezensisNAU-B3（NC 022530.1）序列的同源性最高，達99%。Neighbor-jioning進化樹（圖3）結果表明，菌株HF-09同貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于同一個分支。其中，已報道的貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis157（KY630544）是從杜仲樹皮內分離得到的，具有明顯降解秸稈和豆粕中木質纖維素的能力。綜合菌株形態特征觀察、生理生化特性及16SrRNA分子鑒定結果，確定木質纖維素降解菌HF-09為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 菌株HF-09的系統進化樹

2.3 煙梗纖維素降解

2.3.1 菌株HF-09的生長曲線和耐受性研究 貝萊斯芽孢桿菌HF-09在LB液體培養基中的生長曲線表明（圖4a），7～20 h達對數生長期，20 h之后達到穩定生長期。pH耐受結果表明，菌株HF-09在pH 5～9區間的存活率均在94%以上；溫度耐受結果表明，菌株HF-09在75℃以下的存活率在92%以上（圖4b），表明該菌株具有良好的pH和溫度耐受性。

圖4 菌株HF-09的生長曲線（a）及對p H和溫度的耐受性（b）

2.3.2 菌株HF-09固體發酵降解紅大煙梗（C3F）中的木質纖維素 菌株HF-09對煙梗纖維素、半纖維素和木質素具有不同程度的降解能力，其對半纖維素的降解能力尤為顯著（圖5）。其中，菌株HF-09對纖維素的降解在最初2 d內能力較弱（降解率為0.24%），但發酵6 d后纖維素含量由12.68%下降到10.82%（降解率為14.67%），發酵10 d后含量下降到10.04%（降解率為20.82%）；菌株HF-09對半纖維素的降解速率較為穩定，發酵6 d后半纖維素含量由7.53%下降到5.85%（降解率為22.31%），發酵10 d后含量下降到5.25%（降解率為30.28%）；木質素發酵6 d后，含量由6.05%下降到5.25%（降解率為13.22%），發酵10 d后含量下降到4.88%（降解率為19.34%）。結果表明，該菌分泌多種酶系，并在多種酶系的復合作用下具有明顯的降解煙梗細胞壁物質的能力。

圖5 菌株HF-09降解煙梗木質纖維素含量變化

2.3.3 紅大煙梗（C3F）掃描電鏡觀察 菌株HF-09對紅大煙梗（C3F）進行固體發酵10 d，利用掃描電鏡對煙梗進行組織結構觀察，結果（圖6）表明，菌株HF-09能夠在煙梗表皮組織層良好生長，使原本因富含果膠、蠟質不易被單一酶進行分解的表皮組織層在其作用下破壞明顯，出現明顯的縫隙，有利于HF-09分泌的纖維素降解酶、半纖維素降解酶、木質素酶、淀粉酶等滲入到煙梗組織內部。煙梗橫切面和縱切面電鏡顯示，煙梗組織結構疏松，空隙增大，細胞間連接物質和細胞壁變薄，細胞結構降解明顯。

3 討論

從煙草栽培土壤中分離得到1株具有高效降解煙梗木質纖維素的細菌HF-09，經過形態學、生理生化性質和16SrRNA擴增序列的系統進化分析，該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。該細菌在培養7～20 h達對數生長期，在pH 5～9區間HF-09的存活率均在94%以上；在75℃以下HF-09的存活率均在92%以上。該細菌擁有生長速度快和耐受性強的特征。同時，該菌株可以降解煙梗纖維素、半纖維素、木質素等煙梗細胞壁物質組分，3種物質降解率最低為19.34%，其中煙梗半纖維素的降解率達30.28%。細菌HF-09對煙梗表皮組織和細胞結構具有明顯的分解破壞能力，表明HF-09在卷煙加工和煙草廢棄物資源利用方面具有潛在的應用價值。此外，作為一種耐酸堿和分泌多種酶系的益生菌，菌株HF-09可能有利于煙草原料中還原糖轉化及產香物質的衍生，對加速煙草原料醇化和品質提升可能具有重要應用價值。