高效液相色譜法快速測定保健食品中葉黃素含量研究

＊解恒杰 徐立清 徐大瑋 穆文婕 張洪瀟 姜大勇 劉佩*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院 山東 250100 2.山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心 山東 250100）

前言

葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然物質，屬于類胡蘿卜素的一種，是構成人眼視網膜黃斑區域的主要色素。葉黃素對視網膜中的黃斑有重要保護作用，是幫助眼睛發育的關鍵營養元素，而且人體無法通過自身合成，必須靠攝入葉黃素來補充。新生兒眼睛中的高氧張力及視網膜中存在高濃度易氧化基質，在光和光敏物質作用下，嬰兒的視網膜更加容易受到氧化損害，葉黃素作為抗氧化劑，能夠有助保護視網膜免受氧化損害。在我國食品營養強化劑使用標準中規定調制乳粉中葉黃素含量在1620μg/kg-2700μg/kg，嬰兒配方食品和特殊膳食用食品中含量在300μg/kg-2000μg/kg，較大嬰兒和幼兒配方食品中含量在1620μg/kg-4230μg/kg，目前保健食品中葉黃素含量還沒有規定使用量。

目前檢測葉黃素的方法主要有分光光度法[1-3]，紫外分光光度計法[4]，液相色譜串聯質譜法[5]，薄層掃描法測定[6]，液相色譜法[7-10]。分光度法、紫外分光光度法和薄層掃描法樣品基質易產生干擾，定性定量穩定性差，液相色譜串聯質譜法對于常量添加水平的葉黃素定量不準確，高效液相色譜法穩定性好，靈敏度高。樣品前處理方法主要有：丙酮直接提取法[11]；水溶解樣品后液液萃取法[12]；樣品皂化，蛋白酶酶解后進行液液萃取；國家標準中對于脂肪含量高的樣品經氫氧化鉀溶液皂化后，再以乙醚-正己烷-環己烷（40+40+20，體積比）提取，液相色譜法分離，紫外檢測器檢測，外標法定量。實際試驗中發現皂化后加入混合萃取溶劑后離心時存在液液分層不明顯，不容易取出有機層；合并提取兩次提取液水洗后濃縮近干時較粘稠，不易濃縮近干。按照國標前處理方式進行實驗，效果不好，本文建立了快速簡單的前處理方法，穩定可靠，操作簡單，實驗結果良好。

1.實驗部分

(1)材料與試劑

甲醇（色譜純），美國飛世爾公司；甲基叔丁基醚（色譜純），德國Merk公司；2,6-二叔丁基甲醚（分析純），中國天津科密歐化學試劑有限公司；鹽酸（分析純），中國國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純），中國國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鉀（分析純），中國國藥集團化學試劑有限公司；葉黃素標準物質（純度：≥98%），中國計量科學研究院；有機相濾膜，上海安譜科學儀器有限公司。

(2)儀器與試劑

Alliance 2695型高效液相色譜儀配2998型二極管陣列檢測器，美國Waters公司；BSA822-cw型電子天平，德國Sartorios公司；AB204-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MS3基本型旋渦混合器，德國IKA公司；SB-800DTD型超聲波清洗器，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機，德國Sigma公司；Milli-Q超純水制備器，美國MILLIPORE公司；HGC-24型氮吹儀，中國HENGAO公司。

(3)標準溶液配制

①校正標準溶液

稱取葉黃素標準樣品5mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，以0.1%BHT乙醇溶液配制成濃度約為50μg/mL標準儲備液。標樣校正用含0.1%BHT乙醇配制50μg/mL葉黃素標樣，用甲醇稀釋得到10ug/mL標樣，取1mL用甲醇定容至10mL，在波長445nm下校正，校正公式：

式中，A-標準溶液的吸光度值；E-甲醇中葉黃素的吸光度系數，為2629dL/g；10-稀釋倍數；10000-換算系數（g/dL轉化為μg/mL）。

②配制標準工作溶液

用移液管移取適量的標準儲備溶液用甲醇（含0.1%BHT）依次稀釋成0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1.0ug/mL、2.0ug/mL的標準系列溶液。

(4)高效液相色譜條件

色譜柱：YMC C30，5μm，250mm×4.6mm；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：445nm；進樣量：50μL；流動相：甲醇（含0.1%BHT）-甲基叔丁基醚（含0.1%BHT）梯度洗脫，0-18min甲醇（含0.1%BHT）由95%～10%，18.1min甲醇（含0.1%BHT）變為95%，保留10min。

(5)樣品處理方法

稱取2.00g樣品加0.2g BHT，加5mL 50%（質量濃度）KOH，渦旋分散均勻，加10mL無水乙醇在35℃水浴振蕩45min，取出后冷至室溫，用無水乙醇定容至20mL搖勻，取5mL上述定溶液加1.8mL 6mol/L HCl（調pH至9），并用乙醇定容至10mL，過膜上機。經0.22μm的有機濾膜過濾，濾液供高效液相色譜儀測定。

2.結果與討論

對質量含量較高的樣品前處理方法進行改進，并對其中關鍵控制技術進行研究抗氧化劑使用量、pH值和堿液濃度進行深入研究，建立準確測定高脂肪保健食品中葉黃素含量方法，該方法前處理簡單快速，結果穩定可靠。

(1)BHT使用量的優化

游離態葉黃素長時間在空氣中暴露容易被氧化，會造成目標物提取含量降低。因此在實驗過程中需要加入抗氧化劑BHT，避免目標物被氧化從而造成含量降低。BHT含量不同有不同的抗氧化作用，使用量太少起不到抗氧化的效果，含量太高容易造成試劑浪費。在陰性樣品中添加葉黃素，分別加入0.05g、0.1g、0.2g、0.3g、0.5g BHT，葉黃素提取回收率如圖1所示，在BHT加入量小于0.2g時回收率較低，可能有存在部分目標物被氧化，當BHT加入量達到0.2g時回收率能達到近100%，大于0.2g時，回收率趨于穩定，因此選擇抗氧化劑0.2g BHT最合適。

圖1 BHT使用量對葉黃素提取回收率的影響

(2)KOH濃度的選擇

實驗中皂化過程需要使用KOH，其作用是使脂肪生成脂肪酸鉀，容易溶解于水中，加入量的多少會直接影響提取效率。加入量過少，將會皂化反應不完全，目標物提取不充分，導致結果偏低。分別考察KOH質量濃度為10%、30%、50%、70%和90%時，對陽性樣品中葉黃素皂化提取效率進行研究，結果見圖2所示。當KOH濃度低于50%時陽性樣品葉黃素提取效率低于60%，樣品并未完全被皂化，因此提取效率較低。當KOH濃度達到50%以上時，樣品中葉黃素提取效率接近100%，樣品能夠被完全皂化，提取效率較高。因此選擇KOH濃度為50%作為樣品皂化條件。

圖2 KOH濃度對樣品中葉黃素提取效率影響

(3)pH值的優化

為了考察葉黃素的穩定性，試驗了pH分別為3、5、7、9和12時，研究葉黃素含量提取效率，結果見圖3所示，當pH大于等于9時，提取效率較高且穩定，相對標準偏差較小，但當pH為7時，葉黃素提取效率高，相對標準偏差較大。通過實驗發現，皂化后的提取溶液調節pH值為9時，測定結果穩定。

圖3 pH對樣品中葉黃素提取效率影響

(4)穩定性試驗

為了考察葉黃素的穩定性，分別對葉黃素標準溶液和樣品提取溶液進行實驗，葉黃素標準溶液（濃度為0.06μg/mL）在18h內每隔3h測定一次，記錄峰面及變化值結果見表1所示。實驗結果表明標注溶液和陽性樣品提取溶液在18h內葉黃素響應值沒有顯著變化，相對標準偏差分別為0.58%和0.24%，測定結果穩定。

表1 葉黃素溶液穩定性實驗

(5)方法學考察

①線性范圍和檢出限

將標準工作溶液按照濃度從低到高依次經高效液相色譜法測定，以葉黃素標準工作溶液濃度為橫坐標，以響應值為縱坐標，繪制葉黃素標準工作曲線，標準工作溶液在0.02μg/mL～2.0μg/mL范圍內，線性關系良好，線性回歸方程為：y=6.37×105x+1550，線性相關系數為0.9999。本文采用加標空白樣品基質中標樣對應的響應與背景噪音的比值（S/N=3）計算得到葉黃素的方法檢出限為10μg/100g，當S/N=10時，方法定量限為40μg/100g。

②精密度

對不同保健食品添加165μg/100g，330μg/100g，660μg/100g三個含量水平標物，每個含量水平重復6次，結果見表2所示。樣品含量在43-410μg/100g內，回收率在87.9%-107%范圍內，相對標準偏差在1.6%-3.5%范圍內。

表2 加標回收率結果（n=6）

3.結論

在高效液相色譜法測定高脂肪保健食品中葉黃素含量，對其中關鍵條件進行優化；抗氧化劑使用量，KOH質量濃度和pH優化。通過對關鍵因素進行考察，確定了最佳實驗條件：抗氧化劑BHT使用量0.2g，皂化KOH堿溶液質量濃度為50%，最佳pH提取溶液為9，在最優條件下，標準溶液和提取溶液18h內含量穩定。經過驗證，該方法適用于含乳保健食品中葉黃素含量的測定，前處理條件簡單快速，結果準確可靠，重現性好。