亞致死濃度噻蟲啉對西方蜜蜂工蜂學習記憶的影響

尹令虹 劉永軍 刁青云

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 引言

蜜蜂作為一類重要的傳粉昆蟲，每年為全球農業生產做出巨大貢獻[1]。但近年來世界多個地方均出現蜂群崩潰失調（CCD），造成這種現象的原因主要包括蜜蜂病蟲害、真菌細菌感染、農用化學藥品濫用以及多種因素的協同作用[2-4]，其中新煙堿類殺蟲劑被認為是造成蜂群數量下降的重要因素[5]。新煙堿類殺蟲劑具有神經毒性，在殺滅病害蟲的同時，在水源、植物花蜜和花粉上也有殘留，會對非靶向生物（比如蜜蜂）產生嚴重的影響[6]。新煙堿類殺蟲劑主要作用于蜜蜂的中央神經系統[7]，阻斷乙酰膽堿的正常傳遞，可誘導神經細胞凋亡[8]，蘑菇體失活[9]，從而因影響與采集行為相關的嗅覺、觸覺感知以及學習記憶行為的編碼[10,11]，導致蜜蜂辨別方向和飛行能力下降[12]，影響歸巢能力[13,14]。

蜜蜂對于花朵氣味和花蜜之間的聯想學習記憶對于蜜蜂的采集行為起著重要的作用。蜜蜂學習記憶能力作為蜜蜂健康與否的外在表現，也是檢測化學物質對蜜蜂是否安全的重要指標[15]。有研究表明野外蜜蜂在接觸過新煙堿類殺蟲劑后，記憶能力會下降，主要表現為工蜂的尋巢成功率下降[16]，歸巢時間增加[17,18]。亞致死濃度的吡蟲啉[19,20]或其主要的代謝產物[21]可以導致意大利蜜蜂短時程記憶和長時程嗅覺學習記憶受損[22,23]，Shi 等[24]的研究表明0.5、1、2μg 啶蟲脒均會降低蜜蜂的學習記憶能力。

前人的研究大部分針對成年蜜蜂及蜂群開展研究，蜜蜂整個生命周期共經歷卵、幼蟲、蛹以及成蟲4 個階段，關于蜜蜂幼蟲期暴露在新煙堿類農藥環境中，出房后對蜜蜂影響的相關研究相對較少。Yang等[25]的研究表明幼蟲階段暴露0.04ng 吡蟲啉，會影響成年蜜蜂的學習記憶。此外，目前已有的研究大多針對毒性較大的吡蟲啉、噻蟲嗪開展的，而對毒性較低的噻蟲啉的研究相對較少。我們的研究旨在模擬野外蜜蜂實際生存情況，將意大利蜜蜂幼蟲暴露于不同濃度的噻蟲啉中，去探究亞致死濃度噻蟲啉對意大利蜜蜂的發育以及嗅覺聯想學習記憶能力在經過蛹階段發育后是否仍然受到噻蟲啉的影響，以期為噻蟲啉的合理使用提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 供試蜜蜂

實驗于2020年7月至2020年9月在中國農業科學院蜜蜂研究所進行，實驗蜜蜂為西方蜜蜂（Apis mellifera），取自中國農業科學院蜜蜂研究所北京香山實驗蜂場。

2.2 蜜蜂幼蟲飼料制備

蜜蜂幼蟲食物嚴格按照實驗室飼養方法制備，按照培養天數的不同，飼料分為A、B、C 類（表1），分別由新鮮蜂王漿、酵母粉、果糖、葡萄糖和無菌水按不同比例配置而成[26]。根據蜜蜂幼蟲發育時間分別提供不同種類的飼料，每只幼蟲轉移到實驗室第1～2天提供飼料A 20μl，第3 天提供飼料B 20μl，第4 天提供飼料C 30μl，第5 天提供飼料C 40μl，第6 天提供飼料C 50μl。10mg 噻蟲啉粉末溶解于1ml 二甲基亞砜（DMSO）溶液中，然后添加39ml 蒸餾水配備濃度為250mg/L 的噻蟲啉初始溶液，將配備好的噻蟲啉初始溶液分裝成1ml 管后保存在-80℃冰箱。實驗組幼蟲食用經噻蟲啉處理后的飼料制備，用配好的飼料稀釋噻蟲啉初始溶液分別得到濃度為0.5、1mg/L 的處理飼料，對照組幼蟲提供未添加噻蟲啉的正常飼料。

2.3 蜜蜂幼蟲實驗室飼養

取三張空白的蜂脾，將三只健康的蜂王分別關在不同的蜂脾上供其產卵，將蜂脾分別放入不同的蜂箱中。三日后將成功孵化出的蜜蜂幼蟲小心轉移到滅過菌的48 孔培養皿中，放到培養箱內飼養。培養箱溫度為35℃，濕度為95%。每個濃度處理組在三個不同的蜂脾上各取48只蜜蜂幼蟲組成三個生物學重復，即每個濃度組共取144 只幼蟲。將蜜蜂幼蟲轉移到48孔培養板上的時間記錄為第1 天（D1），整個飼養過程進行18 天（D1-D18）。D1-D6 為蜜蜂幼蟲期，每天的飼料配方如表1所示。待飼養至第7 天將蜜蜂幼蟲轉移到24 孔培養板中繼續飼養，此后蜜蜂幼蟲進入蛹期，在蛹期培養箱溫度保持35℃不變，濕度更改為75%，無需提供食物直至蜜蜂出房。在蜜蜂幼蟲飼養整個過程中，每天統計幼蟲存活數量，并且在第7天轉換培養板時對每只幼蟲進行體重測量。在幼蟲飼養到第8 天，根據每只幼蟲的發育情況，計算不同濃度組的化蛹率。在飼養的第19 天于早上8 時、下午3時分別統計不同處理組蜜蜂的羽化率。

表1 實驗室幼蟲飼養飼料配方

2.4 蜜蜂對蔗糖敏感性行為測試

在飼養的第19 天，從每個處理組隨機選取40 只剛出房的蜜蜂進行伸喙反射（PER）的行為測試。將測試蜜蜂先饑餓處理2 小時后，將蜜蜂固定在空心塑料管中，保證其身體固定，頭部露在管外并且可以自由活動，同時使用攝像頭同步監測拍攝。首先進行蜜蜂對不同濃度蔗糖敏感性的測試：使用裝有濃度為0.5%、1%、5%、10%、30%以及50%蔗糖溶液的注射器分別依次靠近蜜蜂觸角3s，測試記錄每只蜜蜂是否會主動發出伸喙反射，每個測試濃度間隔2 分鐘，在測試過程中蜜蜂沒有真正食用糖水。待測試完畢后，給予蜜蜂1μl 50%的糖水。

2.5 蜜蜂嗅覺學習、記憶行為測試

在蜜蜂對不同濃度蔗糖溶液敏感性行為測試之后，接下來對蜜蜂進行學習和記憶行為的檢測，由于蜜蜂對蔗糖溶液具有正常敏感反應是測試學習記憶能力的基礎，那些僅對50%蔗糖溶液敏感或者對任何濃度蔗糖溶液都沒有伸喙反射行為的蜜蜂在學習記憶行為測試中被剔除了，每個處理組去除2 只蜜蜂。氣味測試裝置由只含有氧氣的主氣流（氣流速度50ml/s）和含有己醛氣味的刺激氣流（5mg/L）混合組成。將浸潤過10μl 己醛（Sigma-Aldrich，CAS# 66-25-1）溶液的試紙條置于刺激氣流的氣道中，使刺激氣流含有己醛氣味。將氣味測試的管道口靠近蜜蜂觸角，測試開始之前，只打開主氣流30s，讓蜜蜂適應一下氣流，然后再進行學習和記憶行為測試。測試分為2 個階段，（1）條件刺激階段（CS）：保持主氣流通道開放，同時打開刺激氣流通道6s，同時在第3s 時給予蜜蜂蔗糖溶液作為獎勵。（2）無條件刺激階段（US）：保持主氣流和氣味刺激氣流開放6s，無蔗糖溶液作為獎勵，觀察蜜蜂是否主動發生伸喙反射。

學習能力測試：蜜蜂每完成1 次條件刺激后進行無條件刺激測試，檢驗其是否主動發生伸喙反射，記錄每只蜜蜂首次發生伸喙反射時使用條件刺激的次數；記憶能力測試：蜜蜂重復5 次學習能力測試后，以1 小時、3 小時和6 小時的間隔再次對蜜蜂進行無條件刺激測試，檢驗其是否主動發生伸喙反射并記錄。每次記憶能力檢測結束后將固定好的蜜蜂放回培養箱內，并且保持每1 小時喂食蜜蜂一小部分的蔗糖溶液以用來維持蜜蜂正常生理反應。

2.6 數據分析

采用SPSS Statistics 17 進行數據分析，使用GraphPad 進行作圖。蜜蜂幼蟲生存分析采用Log-rank檢驗；幼蟲化蛹率、羽化率采用非參數檢驗；蜜蜂幼蟲體重數據符合正態分布和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析；蜜蜂蔗糖溶液敏感性以及學習記憶能力數據分析采用單因素方差分析檢驗。*P ＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。

3 結果與分析

3.1 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂幼蟲存活率的影響

在蜜蜂幼蟲轉移到實驗室的D1 到蜜蜂出房的D18 期間每天對蜜蜂存活情況進行統計，每個噻蟲啉濃度處理組有3 個生物學重復。與對照組相比（圖1），噻蟲啉暴露降低了蜜蜂幼蟲的存活率，高濃度1mg/L 組蜜蜂幼蟲存活率與對照組相比顯著降低，0.5mg/L 濃度組存活率與對照組相比雖然降低但是差異不顯著。

圖1 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂幼蟲生存的影響

3.2 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂幼蟲發育的影響

蜜蜂幼蟲在發育期間，由于亞致死濃度噻蟲啉的暴露導致幼蟲發育遲緩。在整個飼養過程的第8 天蜜蜂幼蟲進入蛹期，如圖2-A 所示，1mg/L 濃度組（高濃度組）蜜蜂的化蛹率顯著低于對照組；如圖2-B 所示，在第19 天高濃度組蜜蜂的羽化率同樣低于對照組蜜蜂的羽化率；在蜜蜂培養的第19 天的上午8 點和下午3 點分別兩次對出房蜂進行收集，如圖2-C 所示，對照組蜜蜂的出房時間主要集中在上午8 點，而實驗組蜜蜂出房時間延后，特別是1mg/L 噻蟲啉濃度處理組蜜蜂出房時間集中在下午3 時（圖2-D）。

圖2 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂幼蟲發育的影響

3.3 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂幼蟲體重的影響

蜜蜂幼蟲在實驗室內培養到第7 天時，轉換培養板，同時進行體重測量，如圖3所示，與對照組相比，0.5、1mg/l 濃度處理組蜜蜂幼蟲體重與對照組相比，均無顯著性變化，結果表明亞致死濃度噻蟲啉暴露對于蜜蜂幼蟲前6 天飼養階段的體重無顯著性影響。

圖3 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂幼蟲體重的影響

3.4 亞致死濃度噻蟲啉對出房蜂蔗糖溶液敏感性的影響

如圖4-A 所示，低濃度（0.5%、1%）和較低濃度（5%、10%）蔗糖溶液測試結果均顯示噻蟲啉處理組蜜蜂對糖產生喙伸反射的比率與對照組相比顯著降低，高濃度（30%、50%）蔗糖測試結果顯示實驗組與對照組對蔗糖產生喙伸反射的比例均不再有統計學差異。結果說明在蜜蜂幼蟲階段接觸亞致死濃度噻蟲啉會降低出房蜜蜂對蔗糖溶液的敏感性，這種影響集中表現在低濃度（0.5%、1%）和較低濃度（5%、10%）蔗糖溶液中，隨著蔗糖溶液濃度的增加，差異不再明顯。圖4-B 從噻蟲啉對蜜蜂蔗糖溶液敏感性的劑量效應曲線可以看出，隨著噻蟲啉暴露濃度的增加，蜜蜂能夠感受到的最低蔗糖溶液濃度不斷上升。

圖4 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂蔗糖敏感性的影響

3.5 亞致死濃度噻蟲啉對出房蜂學習、記憶行為的影響

圖5-A 為噻蟲啉對第1 天出房的蜜蜂學習行為的影響曲線，結果顯示在5 次嗅覺學習過程中，前2次學習測試結果均顯示噻蟲啉暴露會降低蜜蜂學習行為，之后3 次的學習測試結果雖然顯示對照組蜜蜂產生條件喙伸反射的比例仍然高于實驗處理組，但是已不再具有統計學差異。結果表明在幼蟲期間進行亞致死濃度噻蟲啉暴露可以降低出房后蜜蜂的學習能力，這種影響主要體現在前期的學習過程中，隨著訓練的次數增加，影響逐漸消失。圖5-B 是噻蟲啉對蜜蜂學習能力的劑量效應曲線，隨著噻蟲啉暴露濃度的增加，蜜蜂能夠學會條件性伸喙反射所用的學習次數在不斷上升。在學習訓練后的1 小時、3 小時和6 小時的3次記憶測試過程中（圖5-C），1 小時測試結果顯示噻蟲啉降低了實驗處理組蜜蜂產生伸喙反射的記憶，而3 小時和6 小時的記憶測試結果，噻蟲啉處理組和對照組就沒有差異了。結果說明在幼蟲期間進行噻蟲啉暴露可以降低出房后蜜蜂的短期記憶能力，而對蜜蜂的長期記憶影響不顯著。圖5-D 噻蟲啉對蜜蜂記憶能力的劑量效應曲線顯示，隨著噻蟲啉暴露濃度的增加，蜜蜂保存氣味聯想記憶的時間越來越短。

圖5 亞致死濃度噻蟲啉對蜜蜂學習記憶的影響

4 討論

蜜蜂外出采集花蜜花粉會不可避免地接觸到新煙堿類殺蟲劑，分析來自世界各地的198 份蜂蜜樣品發現其中75%的樣品至少含有對乙酰氨基吡啶、可比丁、吡蟲啉、噻蟲啉和噻蟲嗪中的一種[27]，新煙堿類殺蟲劑的系統特性，使得在植物花粉花蜜中都會有農藥殘留，此外在蜂箱以及蜂蠟等蜂類產品也檢測到了新煙堿類農藥的殘留[28]。本研究模擬了野外蜂群受新煙堿類殺蟲劑污染的一種途徑，即外出工蜂采集受污染的花粉花蜜，通過分泌哺育幼蟲的食物從而將新煙堿類殺蟲劑傳遞給正在發育的幼蟲。目前大多數研究大多針對新煙堿類殺蟲劑對成年工蜂的影響作用，本實驗評估了新煙堿類殺蟲劑噻蟲啉對蜜蜂幼蟲發育以及出房后成年蜜蜂學習記憶行為的影響。

我們的研究結果顯示1.0mg/L 的噻蟲啉會顯著降低蜜蜂幼蟲的化蛹率、羽化率，延遲由幼蟲到成蟲的發育時間[29]；增大了蜜蜂幼蟲的死亡率，從而影響了蜂群的數量。這可能是噻蟲啉影響了蜜蜂幼蟲一系列生理生化活動，比如降低幼蟲免疫、排毒過程相關基因的表達[30]，進而影響幼蟲的健康，導致死亡。但是相對較低濃度的噻蟲啉對蜜蜂幼蟲發育的影響不明顯，前人已有的研究結果顯示蜜蜂幼蟲對新煙堿類殺蟲劑的耐受性要比成年蜜蜂強，這可能是由于新煙堿類殺蟲劑主要作用于蜜蜂大腦中乙酰膽堿受體，而該受體的表達在蜜蜂幼蟲階段相對較少，并且其主要的分布區域磨菇體（MBs）在幼蟲階段還沒有發育完全[31]。

亞致死濃度的噻蟲啉不僅影響蜜蜂幼蟲的發育，同時降低了蜜蜂出房后成年蜜蜂的學習效率和短時程記憶。嗅葉是蜜蜂的嗅覺中樞，可以感受到蔗糖溶液的氣味，進而將氣味分子傳遞到用于感官整合的更高級中樞蘑菇體上[32]。新煙堿類殺蟲劑在蜜蜂大腦中可以競爭性地與突觸后膜上的乙酰膽堿受體結合，阻斷神經信號的傳導，由嗅葉接收到的蔗糖溶液的氣味信息傳送不到蘑菇體中，造成蜜蜂對蔗糖溶液敏感性下降[33]。蜜蜂學習記憶能力的形成主要與蘑菇體有關，當蘑菇體損傷后，蜜蜂自然有學習遲鈍、記憶保存時間短等表現。Peng 等[34]發現亞致死劑量的吡蟲啉使蜜蜂蘑菇體中的突觸密度降低，Wu 等[8]發現亞致死劑量吡蟲啉會增加蜜蜂大腦蘑菇體神經細胞的凋亡。

總之，我們的實驗結果顯示，雖然亞致死濃度的噻蟲啉沒有完全殺死蜜蜂幼蟲，但出房后的蜜蜂學習和記憶能力都受到了不同程度的損傷，很可能影響成年蜜蜂的外出采集行為，比如采集花蜜花粉量減少，甚至無法正常回巢，從而影響整個蜂群。雖然噻蟲啉相對低毒，但濃度較低的亞致死濃度就會對蜜蜂幼蟲產生影響。我們的工作可以為安全使用噻蟲啉提供一定的理論指導。