大豆胰蛋白酶抑制劑對工蜂上顎腺脂肪酸分泌能力的影響

陳亞南 吳雨祺 鄭火青 胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

1 引言

充足的營養是蜂群繁殖和發展的基礎，蜜蜂在不同發育階段所需的營養存在差異[1-3]，這為滿足不同發育階段蜜蜂的營養需要增加了復雜性。為了能夠更好地滿足蜂群營養需求，也為了降低蜂群飼養成本，市場上出現了花粉替代物。大豆粉是最常用的花粉代替物的主要成分。大豆胰蛋白酶抑制劑是大豆粉中重要的成分之一，能調節大豆蛋白質的合成和分解，并具有抗蟲作用[4]，對動物和昆蟲的營養吸收具有消極影響[5,6]。研究發現，大豆蛋白酶抑制劑顯著性地降低蜜蜂的生存率和咽下腺的發育，但對食物的消耗沒有顯著影響[7,8]。

上顎腺是位于蜜蜂頭部的一對大型囊狀外分泌腺體。工蜂上顎腺主要負責蜂王漿中脂肪酸的合成，包括10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）及其前體物質10-羥基-癸酸（10-HDAA），這些物質在幼蟲的發育過程及蜂王漿的理化特性中起著重要作用[9,10]。雖然花粉代替物已廣泛使用，但對蜜蜂上顎腺的分泌能力方面的研究甚少。本研究通過不同濃度大豆胰蛋白酶抑制劑飼喂籠養工蜂，探究大豆胰蛋白酶抑制劑對蜜蜂上顎腺脂肪酸分泌能力的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗蜂群的飼養

實驗蜂群為意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica），飼養于浙江大學蠶蜂研究所。為了獲得特定日齡的工蜂，從實驗蜂群中抽取即將出房的封蓋子脾，放置于34.5℃±1℃和70%±5%（RH）的恒溫恒濕箱內過夜以獲取新出房的0日齡工蜂[11]。第二天，將新出房的蜜蜂隨機分為5 組，每一組中1 只成熟的蜂王維持正常蜂群的信息素環境[12]。每籠內約有50 只蜜蜂，放置于30.5℃±1℃。每24h 更換新的飼料，以保持蜜蜂飼料的新鮮。本實驗進行了3 個蜂群的生物學重復。

2.2 大豆胰蛋白酶抑制劑的飼喂

大豆胰蛋白酶抑制劑溶解于40%（W/W）糖漿中通過注射器飼喂籠養蜜蜂（表1）。

表1 實驗室籠養蜜蜂日糧組成

2.3 蜜蜂生存率的測定

實驗過程中每24h 記錄每組蜜蜂的死亡個數并繪制蜜蜂生存曲線。

2.4 工蜂頭部10-HDAA和10-HDA含量的測定

為了評定蜜蜂不同階段脂肪酸的合成能力，在6、9 和12日齡時，收集每個處理組的10 只蜜蜂，將工蜂的頭部分離放置于1.5ml 離心管中，加入1ml 無水乙醇和200μl 的對羥基苯甲酸甲酯乙醇溶液作為內標液，超聲15min。然后將乙醇溶劑透過0.22μm 的有機濾膜過濾到2ml 的樣品瓶中，放置于75℃烘箱內揮發干乙醇，然后加入1ml 乙醚，充分溶解后再次過0.22μm 的有機濾膜過濾到1ml 的GC 樣品瓶，放置于50℃烘箱內揮發。乙醚揮發后，添加400μl 吡啶和50μl BSTFA 后密封（Sigma，Kawasaki，Japan），65℃水浴鍋中進行衍生化反應，最后使用GC-FID 測定工蜂頭部的脂肪酸含量。

2.5 數據分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。工蜂頭部10-HDA 和10-HDAA 含量的比較以及飼養期間工蜂生存率和食物的消耗量，采用單因素方差分析計算差異，P 值＜0.05 認為有統計學意義。所有圖形均由GraphPad Prism 7 生成。

3 結果

3.1 生存率

大豆胰蛋白酶抑制劑處理12d 后，與對照組相比，4 個處理組工蜂的死亡率都出現了下降的現象（圖1），高濃度處理組的工蜂在飼養前幾天顯著降低了蜜蜂生存率，其他3 個處理組在6日齡后呈現下降的趨勢。

圖1 飼喂不同濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑工蜂的生存率

3.2 工蜂頭部10-HDAA和10-HDA含量

與對照組相比，不同水平的大豆胰蛋白酶抑制劑對籠養工蜂脂肪酸合成能力沒有顯著性影響。但發現在6日齡時，大豆胰蛋白酶抑制劑處理組提高了工蜂頭部的10-HDAA 含量。但是隨著飼養時間的增加，處理組對工蜂頭部10-HDAA 和10-HDA 含量的影響減弱（圖2、圖3）。

圖2 不同水平大豆胰蛋白酶抑制劑條件下籠養工蜂頭部10-HDAA含量

圖3 不同水平大豆胰蛋白酶抑制劑條件下籠養工蜂頭部10-HDA含量

4 討論

大豆粉是代用花粉中最常用的原料。前人研究表明，以大豆粉為基礎的花粉代用品降低了工蜂壽命和食物消耗量[13]。在腺體發育中代用花粉處理組降低了工蜂咽下腺腺泡，同時不同代用花粉的腺泡大小有一定的差異，但是通過改變營養的組成能夠進一步提高代用花粉的營養效果[14]。

在我們的研究中，發現高濃度的大豆胰蛋白酶抑制處理組對籠養工蜂的生存率有降低的作用，這與前人的研究結果相類似[8,9]。代用花粉的使用對蜂王漿生產中重要的咽下腺的發育有顯著性影響[7]，同時在蜜蜂的嗅覺方面也有一定的消極影響[15]，這可能是由蜜蜂食物獲取的敏感性降低所致。本研究結果顯示，不同水平的大豆胰蛋白酶抑制劑對籠養工蜂脂肪酸合成能力沒有顯著性的影響，但是發現在6日齡時提高了工蜂頭部的10-HDAA 含量；隨著飼養時間的增加，處理組對飼養工蜂頭部10-HDAA 和10-HDA 含量的影響減弱。表明大豆胰蛋白酶抑制劑對工蜂上顎腺分泌能力的影響隨著飼養時間的增加而減弱，這個過程具體是如何產生影響的，還需要進一步的研究。