黔產瑪咖氨基酸的含量測定及價值分析

楊衛靈， 楊 娜， 宋小娟， 張清海

(貴州醫科大學 食品科學學院， 貴州 貴陽 550025)

引言

【研究意義】瑪咖(LepidiummeyeniiWalp)為十字花科獨行菜屬一年生或兩年生草本植物，原產于秘魯安第斯山脈，從2002年開始引種國內，在云南、吉林、新疆、湖南、貴州等多地均有種植基地，2011年被衛生部批準為“新資源食品”[1-2]。瑪咖含豐富的蛋白質、氨基酸、牛磺酸、礦物質、多糖等營養成分和瑪咖烯、瑪咖酰胺等生物堿活性成分[3-4]，具有“南美人參”的美譽，有抗疲勞、增強性功能、增強免疫力、抑制癌細胞、抗氧化、提高生育能力等功效[5-6]。瑪咖兼具藥用功效和營養價值，以其為原料的保健食品、食品日益增多。由于瑪咖種植地域存在差異，品種不一，質量參差不齊，建立簡便準確的氨基酸測定方法，對瑪咖的鑒別、質量控制具有重要意義。【前人研究進展】目前，關于國內引種瑪咖的研究產地主要為云南，也有少部分來自于新疆、四川、寧夏等地，多為活性成分的提取、鑒定、功能活性等研究，對于黔產瑪咖氨基酸含量測定及組成分析鮮有報道。現代藥理學研究表明，瑪咖抗疲勞功效與支鏈氨基酸有關[7]，性功能與生育能力的提高則與精氨酸緊密相關[8]。氨基酸在人體代謝中具有非常重要的功能，如天冬氨酸(Asp)能緩解疲勞，能夠增強肝功能；谷氨酸(Glu)通過合成谷氨酰胺，解除氨毒害，具有健腦益智作用[9]；Arg能增強免疫、增強性功能、促進胰島素釋放從而治療糖尿病[10]；甘氨酸(Gly)具有抗炎、護肝、提高運動能力的作用[11]；蛋氨酸(Met)能預防脂肪肝[12]；亮氨酸(Leu)能促進胃液分泌；賴氨酸(Lys)是大腦神經細胞再生的第一限制性氨基酸，其缺乏影響大腦發育[13]。【研究切入點】明確黔產瑪咖中氨基酸的含量及組成，對進一步研究其藥理作用具有指導作用，為黔產瑪咖的功效研究及新產品開發提供新思路。異硫氰酸苯酯(PITC)作為衍生化試劑，與一級、二級氨基酸均能發生反應，且不生成對氨基酸測定有干擾的副產物，所得產物苯基硫酸鹽-氨基酸(PTC-AA)穩定性好。【擬解決的關鍵問題】采用異硫氰酸苯酯(PITC)為柱前衍生劑，RP-HPLC方法測定黔產瑪咖中的氨基酸含量，并分析其氨基酸組成，為黔產瑪咖氨基酸的測定及其應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 瑪咖購自貴州威寧產地，異硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺(Bonna-Agela Technologies 公司)，正亮氨酸(Nle)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)對照品(北京索萊寶科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；水為哇哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，配置安捷倫色譜工作站、DAD檢測器)，SK-1型快速混勻器(金壇市醫藥儀器廠)，101型恒溫干燥箱(天津泰斯特公司)，AL-204電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，RV 8型旋轉蒸發儀(德國IKA公司)，pH-3C型pH計(上海雷磁)。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品 精密稱取各氨基酸對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成含天冬氨酸1.112 mg/mL、谷氨酸1.145 mg/mL、絲氨酸0.805 mg/mL、甘氨酸0.721 mg/mL、組氨酸0.785 mg/mL、精氨酸0.932 mg/mL、蘇氨酸0.820 mg/mL、丙氨酸0.787 mg/mL、脯氨酸1.235 mg/mL、酪氨酸0.724 mg/mL、纈氨酸0.736 mg/mL、蛋氨酸0.751 mg/mL、半胱氨酸1.325 mg/mL、異亮氨酸1.147 mg/mL、亮氨酸0.818 mg/mL、苯丙氨酸0.668 mg/mL、賴氨酸0.735 mg/mL的混合對照品儲備液。

1.2.2 供試品 精密稱取過100目篩的瑪咖樣品約0.1 g，置聚四氟乙烯水解罐中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，于恒溫烘箱中115℃水解22 h，取出冷卻，過濾于25 mL容量瓶中，用純凈水洗滌濾渣并定容至刻度。將溶液置于旋轉蒸發儀上70℃濃縮近干，用純凈水溶解，將溶液轉入10 mL容量瓶中，定容，即得。

1.3 柱前衍生化

精密移取對照品溶液、供試品溶液各200 μL，置2.0 mL玻璃離心管中，準確加入1.0 mg/mL正亮氨酸20 μL，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，混勻，40℃衍生化反應1 h，冷卻至室溫，加入正二氯甲烷500 μL，渦旋振蕩混勻后，靜置10 min，用注射器吸取上層溶液，經0.45 μm濾膜過濾后進樣進行色譜分析。

1.4 方法學考察

分別吸取氨基酸對照品儲備液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，衍生化反應后進樣測試，以質量濃度(mg/L)為橫坐標x，氨基酸峰面積與正亮氨酸面積比值為縱坐標y，進行線性回歸；并進行精密度、穩定性、重復性考察，方法回收率試驗。

1.5 色譜條件

Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉溶液-乙酸(V:V：V=8︰92︰0.05)，流動相B為乙腈-水(V︰V=75︰25)，梯度洗脫(3～10 min，0～10%B；11～15 min，10%～22%B；16～30 min，22%～29%B；30～31 min，29%～60%B；31～40 min，60%～80%B)，進樣量2 μL，流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長254 nm。上述色譜條件下，色譜圖見圖1。

注：1～18分別為天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸(內標)、苯丙氨酸、賴氨酸。A為氨基酸HPLC標準色譜；B圖為黔產瑪咖樣品HPLC色譜。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

儀器精密度RSD小于1.4%(n=6)；衍生化產物在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h內的穩定性除胱氨酸以外，其他氨基酸衍生物24 h穩定性RSD均小于3%，胱氨酸衍生物穩定性較差，需要在12 h內測定；瑪咖樣品重復處理然后進樣測定，方法重現性RSD均小于5%(n=6)；對已知含量的瑪咖樣品中加入氨基酸對照品，進行樣品處理、進樣測試，17種氨基酸的平均回收率為91.3%～104.6%，RSD均小于5%(n=3)。表明，化合物在給定的濃度范圍內線性關系良好，靈敏度高。

表1 17種氨基酸的線性關系

2.2 黔產瑪咖的氨基酸組成

瑪咖樣品中，檢出的氨基酸種類為17種，氨基酸總量達154.49 mg/g，Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe和Lys的含量分別為3.29 mg/g、8.92 mg/g、4.60 mg/g、4.25 mg/g、2.30 mg/g、4.80 mg/g、21.57 mg/g、37.89 mg/g、39.37 mg/g、2.27 mg/g、0.97 mg/g、6.39 mg/g、1.18 mg/g、4.00 mg/g、3.53 mg/g、3.35 mg/g和5.81 mg/g。人體必需氨基酸Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys總含量達45.62 mg/g，占氨基酸總量的30.0%；Thr在必需氨基酸中的含量最高，占氨基酸總量的13.9%；Val的含量最低，占總氨基總量的0.62%。非必需氨基酸Pro含量最高，占氨基酸總量的25.5%；Cys最低，占氨基酸總量的0.76%。必需氨基酸與總氨基酸比值為29.5%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為41.9%。

2.3 黔產瑪咖各類氨基酸含量

由表2可知，鮮味(Lys、Glu、Asp)、甜味(Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His)、苦味(Val、Leu、Ile、Met、Arg)3類呈味氨基酸中，甜味氨基酸含量高于鮮味類和苦味類氨基酸，占總氨基酸比例的69.7%，甜味類氨基酸能有效增強食物的口感，這為瑪咖的食用性與產品開發提供了解釋。瑪咖的藥效氨基酸(Asp、Glu、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys)達42.61 mg/g，占總氨基酸的27.58%。瑪咖支鏈氨基酸(Val、Ile、Leu)含量為8.5 mg/g，芳香族氨基酸(Phe、Tyr)含量為5.61 mg/g，支鏈氨基酸有提高運動能力、促進肌肉生長、生長激素釋放[14]，芳香族氨基酸對食品的風味起著重要的作用。瑪咖帶正電荷極性氨基酸(His、Lys、Arg)的含量為12.91 mg/g，帶負電荷極性氨基酸(Asp、Glu)為12.21 mg/g，具有高效殺菌作用的抗菌肽的形成與帶電荷的氨基酸密切相關[15]，抗菌肽促進過氧化氫分解，降低自氧化速率和減少脂質過氧化氫含量，瑪咖中脯氨酸和甘氨酸的含量達到77.26 mg/g，抗菌肽的形成與這兩種氨基酸密切相關。

表2 黔產瑪咖各類氨基酸的含量

2.4 黔產瑪咖與其他藥食兩用植物的氨基酸組成及含量

由表3可知，與天麻、石斛、黨參、肉蓯蓉、黃芪、芡實、紅棗、枸杞、山藥、金銀花10種廣泛使用的藥食兩用植物比較[16-25]，黔產瑪咖的總氨基酸及必需氨基酸的含量均高于天麻等10種植物；黔產瑪咖藥效氨基酸的含量高于石斛、黨參、紅棗、枸杞，低于天麻、肉蓯蓉、黃芪、芡實、山藥、金銀花，分別為天麻、石斛、黨參、肉蓯蓉、黃芪、芡實、紅棗、枸杞、山藥、金銀花藥效氨基酸的0.60倍、1.72倍、1.30倍、0.93倍、0.97倍、0.61倍、2.28倍、1.00倍、0.93倍、0.65倍。

表3 黔產瑪咖與其他藥食兩用植物的氨基酸組成與含量

3 討論

3.1 衍生劑凈化考察

為了保證樣品能夠充分反應，加入的異硫氰酸苯酯衍生化試劑的量應多余理論量，PITC試劑進入柱子后，導致柱子老化，縮短使用壽命，需要在進樣前去除多余的PITC衍生化試劑。經典去除PITC的方法是用正己烷萃取法，正己烷的密度比較小，處于上層，用注射器取溶液時可能將上層溶液帶入下層。在密度比水大的二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷中，二氯甲烷萃取后殘余的PITC峰最小，且背景干擾得以改善。因此，最終選擇二氯甲烷試劑作為凈化試劑。

3.2 衍生樣品穩定性考察

對氨基酸與PITC試劑衍生反應的產物在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h內進行穩定性考察試驗表明，半胱氨酸衍生產物的穩定性在12 h以內測定結果的RSD在3%以內，但在24 h測定時，該峰峰面積大幅度減小。PITC衍生化的原理是氨基酸中的氨基與PITC反應生成苯胺酸硫甲酰衍生物，衍生產物的穩定性較高，但半胱氨酸為含硫氨基酸，結構式中含有一個巰基(-SH)活性基團，在空氣中易被氧化，2個半胱氨酸巰基之間也會發生交聯生成二硫鍵(-S-S-)而轉變成胱氨酸。半胱氨酸衍生物的穩定性是否與其存在的巰基有關，需要進一步探索研究。

3.3 黔產瑪咖氨基酸的組成與應用

WHO/FAO規定的理想蛋白質必需氨基酸與總氨基酸比值為40.0%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為60%[26]，黔產瑪咖氨基酸的組成低于WHO/FAO規定的理想蛋白質比值，單一食用不利于人體吸收。黔產瑪咖具有豐富的氨基酸組成，與天麻等10種藥食兩用植物對比分析，黔產瑪咖的總氨基酸、必需氨基酸和藥效氨基酸較為豐富，從中研發出更多的新型功能性食品，代替一些氨基酸的補充劑，更安全、綠色；瑪咖抗疲勞、增強免疫能力、增強性功能等作用已有報道，這些功能與其中富含的藥用氨基酸存在一定關系，與其他食品或者藥材配伍生產新的保健食品。明確黔產瑪咖氨基酸的組成含量及價值，以期對其質量控制提供參考依據，為藥理學、藥效學、蛋白組學進一步研究提供一定的理論數據，使人們更加清楚瑪咖的功效作用，為瑪咖的發展再尋找新出路。

4 結論

黔產瑪咖中含有17種氨基酸，氨基酸總量為154.49 mg/g，高于常見的天麻、石斛、黨參、肉蓯蓉、黃芪、芡實、紅棗、枸杞、山藥、金銀花等藥食兩用植物；必需氨基酸、藥效氨基酸和甜味氨基酸含量分別為45.62 mg/g、42.61 mg/g和107.68 mg/g，分別占氨基酸總量的29.5%、69.7%和27.58%。與天麻等其他10種藥食兩用植物對比，黔產瑪咖的總氨基酸、必需氨基酸和藥效氨基酸較為豐富，黔產瑪咖氨基酸種類齊全且含量豐富，具有較高的開發利用價值。未知領域的瑪咖功效需要更深入研究，瑪咖的特殊功效氨基酸在醫療保健食品領域具有廣闊的開發前景。