貴州道地藥材杜仲內生真菌的分離及鑒定

陳曉芳， 李明健

(畢節醫學高等專科學校， 貴州畢節 551700)

引言

【研究意義】杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)植物，為我國特有的藥用樹種，是國家二級保護植物[1]。杜仲植株中含有松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、綠原酸、桃葉珊瑚苷、槲皮素、山奈酚等豐富的化學物質，在抗菌、抗腫瘤、治療心腦血管疾病、抗衰老、增強免疫力、安胎等方面有藥理活性[2-3]。植物內生真菌是指其生活史或生活史中的某個時期生活于健康植物組織或細胞間隙中，而對宿主植株本身沒有明顯病害癥狀的真菌[4]。【前人研究進展】目前，許多研究者已從杜仲內生真菌發酵產物中檢測到與杜仲相似藥效的活性物質，如PDG、綠原酸、黃酮類等，這些成分是評價藥用杜仲藥材質量的重要指標[5]。道地性是中藥藥材的重要特點，道地藥材離不開其特有的生態環境[6]。楊娟等[7]研究表明，杜仲內生真菌群落組成與杜仲的活性成分有關聯。同一種植物在不同生長環境，其內生真菌的多樣性及生物活性均有差別，作為構成植物內環境的重要組分，杜仲內生真菌對宿主的生長和代謝產物的積累以及藥材品質等方面均產生較大影響[8]。作為道地性藥材，不同產地杜仲品質不一，而貴州的杜仲品質好，這與作為杜仲內環境的菌落結構有著不可分割的聯系。康傳志等[9]研究表明，貴州最適宜種植和生長杜仲的區域是畢節市、大方縣等地。【研究切入點】為更好的開發利用貴州杜仲內生真菌資源，目前亟需要解決杜仲與內生真菌相互關系、真菌產生活性物質的機制等方面的問題。【擬解決的關鍵問題】采用傳統組織培養法對貴州采自畢節市和大方縣道地藥材杜仲進行內生真菌的分離及鑒定，旨在開發有地域特色的杜仲內生真菌資源，為杜仲內生真菌多樣性和內生真菌的開發利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物來源 杜仲樣本采集自畢節七星關區和大方縣，選取離地面2 m以上的無病斑新鮮的杜仲枝條，用無菌水反復沖洗干凈，晾干備用。

1.1.2 培養基 PDA培養基來自北京奧博星生物技術有限公司(貨號02-023)。青霉素-鏈霉素溶液來自biosharp生物科技公司，有效成分為1 mL含100 000單位青霉素和10 mg鏈霉素，稀釋100倍使用。

1.2 內生真菌的分離

內生真菌分離采用組織塊培養法。將表面處理干凈的杜仲枝條放在無菌超凈臺上切段約5 cm，放入75%的醫用酒精浸泡3 min，取出后依次用裝有無菌水的3個滅菌小燒杯中清洗，然后用無菌水流水沖洗，滅菌濾紙吸干水分。無菌解剖刀剝去枝條兩端部分和中間的木質部，取韌皮部將其切成5 mm2的組織塊。在每個PDA培養基平皿(含青霉素-鏈霉素)上分開放置2個組織塊倒扣于28℃的培養箱培養3～7 d。

對照試驗：1)漂洗液檢驗法。取最后一次沖洗杜仲枝條的無菌水涂布于PDA平板上，28℃恒溫培養3～4 d。2)組織印跡法。將上述表面滅菌處理的完整枝條壓入PDA培養基中，使枝條滅菌表面與培養基接觸30 min后，移除植物材料，培養基28℃恒溫培養3～4 d。觀察有無菌落產生，以確保杜仲材料表面滅菌徹底，分離出的真菌為內生真菌。

1.3 內生真菌的純化、保存

杜仲組織塊培養后每天觀察，當發現塊莖切口處長出菌絲時，立即將菌絲轉接到新的PDA培養基上相同條件下恒溫培養。在分離過程中根據組織塊切口旁長出的菌落形態、顏色差異及生長時間等不同，分別挑取菌落邊緣的菌絲至新PDA平板上進行分離培養。后續采用菌絲頂端純化法進行2～3次的分離純化，得到純化菌株。對純化菌株編號后，轉至PDA試管斜面培養基，于28℃培養箱中培養5～7 d，然后放入4℃冰箱保存。

1.4 內生菌株的ITS分子鑒定

采用CTAB法提取內生真菌基因組DNA。采用在真菌ITS測序通用引物對ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR擴增。PCR反應體系共20 μL：ddH2O 12.8 μL，10×Buffer 2 μL，模板DNA 1.0 μL，正反向引物(10 μmol/L，ITS1和ITS4)各1.0 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL)0.2 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環；72℃延伸10 min。反應結束后PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物純化后委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。擴增序列用GenBank核酸序列數據庫Blast程序進行內生真菌ITS序列的相似性比對分析。

1.5 內生菌株的形態學鑒定

將純化菌株用打孔器接種到PDA培養基，28℃培養箱中培養15 d，每日固定時間觀察并記錄菌落生長情況和形態特征。同時做真菌學插片培養和直接制片的方法觀察真菌菌絲和孢子的形態結構特征。根據真菌形態特征參考《真菌鑒定手冊》并結合真菌ITS序列Blast結果進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 內生真菌分離鑒定

由表1可見，在畢節市杜仲中共分離得到內生真菌93株。根據菌株在培養基上生長的速度、菌絲生長狀態變化、產生的顏色等特征，結合顯微鏡檢的菌絲結構和孢子形態等特點，并結合真菌ITS序列進行分類，共鑒定出擬莖點霉屬、間座殼屬等9屬，杜仲內生真菌具有一定的多樣性，其中占絕對優勢的種群為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)，分別占54.83%和26.88%，其次為黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黑孢屬(Nigrosporasp.)。

表1 杜仲內生真菌的形態特征與分類

2.2 部分內生真菌菌落形態及結構特征

杜仲內生真菌形態多樣，其中間座殼(Diaporthesp.)，白色短絨毛，菌落中部黑色突起為載孢體，孢子透明，a為含有2個油滴的α型孢子呈紡錘體狀，b為呈線鉤狀的β型孢子(圖1-1)；銳頂炭角菌(Xylariaapiculata)，菌落底層白色長菌毛，表面黑褐色，長出典型的似牙簽的細棒狀子座，粗糙革質，尖端白色(圖1-2)；黑附球菌(Epicoccumnigrum)，菌落為鮮艷的粉紅色(圖1-3)；刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)，黑灰色菌落，孢子呈紡錘形或新月形，有或無隔(圖1-4)；黑孢屬(Nigrosporasp.)，白色菌毛發達，有該菌屬典型的黑而大、圓的孢子(圖1-5)。

注：1為間座殼(Diaporthe sp.)平板形態(30 d)及孢子(100×)，a為α型孢子，b為β型孢子；2為銳頂炭角菌(Xylaria apiculata)平板特征(30 d)；3為黑附球菌(Epicoccum nigrum)平板特征(15 d)；4為刺盤孢屬(Colletotrichum sp.)平板特征(7 d，30 d)及孢子(40×)；5為黑孢屬(Nigrospora sp.)平板特征(30 d)及孢子(40×)。

3 討論

研究分離得到的杜仲內生真菌經擬莖點霉屬、間座殼屬等9屬，占絕對優勢的種群為擬莖點霉屬，與楊明琰等[10-11]研究結果均不一致，但梁雪娟[8]采自貴州遵義的杜仲分離得到的內生真菌與研究有1個相同點，均為擬莖點霉屬和間座殼屬為優勢種群。表明，不同地域的杜仲內生真菌在種群結構上存在較大差異，優勢菌株組成不同，但是貴州遵義和畢節的杜仲內生真菌優勢種群相同。表明，藥材杜仲的地道性和地理環境有關系。

擬莖點霉屬其有性型為間座殼屬，目前已知的有900多種，由于其種類多且不同的生長環境和不同的寄主導致其在生態學方面有較大差異。目前，雖對擬莖點霉的生物學特性有較多報道，但至今仍未有該屬生物學特性較一致的描述[12]。李愛華等[13-14]研究發現能夠產生松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的杜仲內生真菌擬莖點菌屬菌株。因此，對杜仲內生真菌擬莖點霉有進一步研究開發的價值。

目前，銳頂炭角菌(Xylariaapiculata)、小光殼屬(Leptosphaerulinasp.)和大白栓菌(Trameteslactinea)菌株是從杜仲中分離得到的首次報導小光殼屬菌株國內研究極少，僅見該屬中花生焦斑病菌(Leptosphaerulinaarachidicola)的報道[15]。同樣研究極少的是大白栓菌，該菌作為天麻的萌發菌近年才有相關研究[16]。銳頂炭角菌為炭角菌屬(xylariasp.)，是一類有重要研究價值的真菌，目前銳頂炭角菌作為石斛內生真菌已有相關的研究報道[17]。這些分離得到數量較少，相關研究稀缺且為杜仲內生真菌的首次報道，作為杜仲內生真菌資源的一部分，具有進一步研究潛力。

另外，研究分離得到3株糞殼球菌屬和4株黑孢屬菌株，CHEN等[18]的研究中鑒定為糞殼菌的杜仲內生真菌能夠產生和杜仲藥用成分一致的綠原酸活性物質；張維瑞等[19]發現1株能夠產生綠原酸的杜仲內生真菌，經分子鑒定隸屬于黑孢屬。其他菌株在杜仲內生真菌中均在相關研究中分離得到。有些菌株不產孢，需結合分子序列Blast結果進行鑒定，可能這些菌在PDA平板上不產生孢子，需要特殊的環境條件才能產孢，也可能在長期與宿主植株共生的過程中，為適應環境在體外培養時不再產孢子或子實體，這些機理需要進一步研究。

4 結論

試驗在畢節市杜仲中分離得到的93株杜仲內生真菌，經生態學和分子鑒定為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、間座殼屬(DiaportheVsp.)、黑孢屬(Nigrosporasp.)、糞殼菌屬(SordarialesV sp)、黑附球菌(Epicoccumnigrum)、小光殼屬(Leptosphaerulinasp.)、銳頂炭角菌(Xylariaapiculata)、刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)和大白栓菌(Trameteslactinea)共9屬，其中占絕對優勢的種群為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)，分別占54.83%和占26.88%，其次為黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黑孢屬(Nigrosporasp.)且種群結構特征與目前已有的報道不同，說明杜仲內生真菌資源豐富，且杜仲內生真菌炭角菌屬、大白栓菌在我國屬于首次報道。