除蟲脲在人工胃/腸液和腸道菌群及生物樣品中的穩定性研究

陶 琦，徐玉珍，秦 哲，白莉霞，劉希望，李世宏，楊亞軍，李劍勇

(中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農業農村部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

隨著生活水平的提高，人們對動物性食品的需求量不斷增加。在畜牧養殖業的發展過程中，人們對養殖環境的衛生狀況也越來越重視。蠅類的繁殖能力強，分布廣泛，可在養殖場環境中大量孳生，不但襲擾動物和養殖人員，還可傳播多種疾病，給養殖場的正常生產及生活造成干擾，同時也是養殖場生物安全的威脅之一。目前，不同規模的養殖場均存在蠅類孳生的問題，通常采用環境、生物、物理、化學等措施進行蠅蟲數量的防控[1-3]。其中，在化學防控措施中，環丙氨嗪(cyromazine)已在國內被批準使用于雞[4-7]；除此之外，在國外畜牧養殖過程中除蟲脲的使用亦較為廣泛[8]。

口服是最為便捷的給藥途徑之一。但大多數藥物經口服給藥后，會受到胃腸道中多種因素的影響，如胃液的酸性和腸液的堿性環境、胃腸道消化酶、腸道上皮細胞中的酶，以及腸道菌群的影響等，使其在到達作用部位前發生降解和代謝。前期研究發現，除蟲脲在動物體內代謝較少，絕大部分以原型藥隨糞便排出[16-20]。本研究擬采用高效液相色譜(HPLC)，考察DFB在人工胃/腸液和生物樣品中的穩定性，同時還考察了大鼠腸道菌群對DFB的降解作用，為后續的制劑設計和開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

除蟲脲標準物質(中國計量科學研究院，批號：19001，純度>99.8%)；烏拉坦(NJKOCED)；胰蛋白酶(酶活 250NFU/mg，索萊寶，批號：T8150)；胃蛋白酶(酶活3 000～3 500 NFU/g 索萊寶，批號：P8390)；磷酸鹽緩沖液(索萊寶，批號：D1040-500)；厭氧培養基(CM1513 北京陸橋)；泊洛沙姆188(索萊寶，批號：S7070)；乙腈(色譜純，Fisher)；鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為國產分析純試劑。

1.2 主要儀器

超高效液相色譜儀-紫外檢測器(DAD)，安捷倫1290；勻漿機(IKA-T25)；離心機(Multifuge X3R)；厭氧培養箱(Thermo)。

1.3 試驗動物

6只清潔級SD大鼠，雄性，8～10周，體質量210～230 g，購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所，動物生產許可證號：NKMYD201907018。

1.4 溶液配制

1.4.1 儲備液與溶液 稱取除蟲脲標準物質適量，以乙腈溶解制成質量濃度為1 mg/mL的儲備液，于4 ℃儲備。使用前用乙腈稀釋得到相應質量濃度的對照品溶液。

1.4.2 人工胃液的制備 按文獻[21]的方法，取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋至1 000 mL)16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，用3.65 g/L鹽酸溶液調pH至1.3，然后加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液。空白人工胃液的配制：除不含胃蛋白酶，其余與人工胃液配制相同。

1.4.3 人工腸液的制備 按文獻[21]的方法，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用4 g/L氫氧化鈉溶液調節pH至6.8；稱取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解；將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容到1 000 mL，即得人工腸液。空白人工腸液的配制：除不含胰蛋白酶，其余與人工腸液配制相同。

1.4.4 SD大鼠腸道菌群的制備[22-23]SD大鼠禁食12 h刺激腹部采集新鮮糞便。將糞便與生理鹽水按比例(1 g︰5 mL)渦旋混合制成懸濁液，2 000 g離心10 min(4 ℃)，再將上清液與厭氧培養液按比例(1︰9)混合，置厭氧培養箱中過夜，制得腸道菌群培養液，待用。

1.4.5 空白組織樣品的制備[24-26]取SD大鼠(230～250 g)6只，禁食不禁水過夜，腹腔注射烏拉坦麻醉，迅速處死，取出肝臟、胃、小腸和大腸，用預冷的磷酸鹽緩沖液(4 ℃預冷2 h)沖洗表面后剪碎，再將各組織與磷酸鹽緩沖液按比例(1 g︰5 mL)混合，置于勻漿機中均質后，2 000 g離心10 min(4 ℃)，取上清液，備用。上述操作均在冰浴條件下進行。

1.4.6 厭氧培養基的制備 稱取厭氧培養基 9.5 g，加水800 mL搖勻，然后加水稀釋并定容到1 000 mL，高壓滅菌后分裝到試管中，制成厭氧培養基(GAM)，4 ℃保存，備用。

1.5 色譜條件與方法學考察

1.5.1 色譜條件 參照文獻[27]，略有調整。Phenomenex luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相(A)為6.3 g/L甲酸銨，(B)為乙腈，等度洗脫(A與B的體積比為40︰60)；進樣時間15 min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。

1.5.2 方法學考察 方法專屬性：分別取空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液、人工胃液+DFB儲備液、人工腸液+ DFB儲備液、空白人工胃液+ DFB儲備液、空白腸道菌液、空白肝液、空白胃液、空白大腸及其內容物、空白小腸及其內容物。按照“1.5”項下的樣品處理方法操作后，按“1.5.1”項下的色譜條件進樣分析，對比色譜圖。觀察BFD標準品的出峰位置是否有其他物質干擾。

精密度試驗：精密吸取DFB儲備液10、40、100 μg/mL各1份，在不同時間點(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h)按照 “1.5.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積。

重現性試驗：精密吸取DFB儲備液10、40、100 μg/mL各6份，再按“1.5.1”項下進樣1次，記錄峰面積。

1.6 樣品處理

1.6.1 人工胃/腸液樣品處理 移取DFB儲備液4份(1 mg/mL)，每份500 μL，分別置于 50 mL容量瓶中，由于DFB的水溶性差，在人工胃、腸液加入一定量的增溶劑泊洛沙姆188，以增加DFB在樣品中的溶解性，然后分別用處理過的空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液稀釋并定容，充分混勻后，再分裝EP管中(每管 1 mL，每個時間點平行3份)，于37 ℃水浴中孵育不同時間后分別取樣300 μL，加入冰乙腈700 μL以終止反應，渦旋混勻，于4 ℃下14 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按 “1.5”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。

1.6.2 SD大鼠腸道菌群處理 在前述過夜培養液加入一定量的增溶劑泊洛沙姆188，以增加DFB的溶解性，移取1 mL培養液于EP管中，分別加入DFB儲備液10 μL，渦旋混勻后置入厭氧培養箱，培養不同時間后分別取樣0.5 mL于EP管中(每個時間點平行3份)，加入冰乙腈(-20 ℃預冷2 h)1 mL以終止反應，12 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。以培養相同時長不含DFB的培養液為空白對照，同法 操作。

1.6.3 空白組織樣品處理 在上清液中加入一定量的增溶劑泊洛沙姆188來增加DFB在樣品中的溶解性。將上述制備好的上清液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個時間點平行3份)，加入DFB儲備液10 μL，混勻后置37 ℃水浴中孵育不同時間后，移取300 μL，加入700 μL冰乙腈以終止反應，渦旋2 min，14 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。

2 結果與分析

2.1 方法專屬性

如圖1所示，在該色譜條件下，DFB能被檢出，保留時間為5.30 min，分離度良好，不受其他物質干擾。表明樣品測定條件以及處理方法具有專屬性，不受基質干擾。

2.2 精密度試驗

DFB低、中、高3種質量濃度在不同時間點測得峰面積如表1所示。RSD 值為分別為 0.1%、0.12%、0.18%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗結果

2.3 重現性試驗

不同樣品測得峰面積見表2。RSD值分別為0.1%、0.12%、0.18%，表明方法的重現性良好。

表2 方法重現性結果

2.4 DFB在人工胃/腸液中的穩定性

以0 h時DFB的峰面積為100%，計算各時間點的剩余百分比，結果見圖2。如圖所示，經過6 h、37 ℃孵育后，在空白胃液、人工胃液及空白腸液、人工腸液中的相對剩余百分率分別為(93.23±1.55)%、(92.46±2.33)%、(82.97± 1.13)%、(77.41±0.74)%。結果說明，在堿性或胰蛋白酶存在的條件下，DFB相對于在酸性或胃蛋白酶存在的環境中更易被降解；DFB在堿性或胰蛋白酶的條件下穩定性較差(約下降20%)，而不易受酸性及胃蛋白酶的影響。

2.5 DFB在SD大鼠腸道菌群中的穩定性

以0 h時DFB的峰面積為100%，計算各時間點的剩余百分比，結果見圖3。如圖所示，經過12 h、37 ℃ 孵育后，DFB在SD大鼠腸道菌群中孵育時發生了相對降解，但相對剩余百分率在90%上，總體表現出穩定的趨勢。結果表明，DFB不易受SD大鼠腸道菌群的影響。

2.6 DFB在生物樣品中的穩定性

以0 h時DFB的峰面積為100%，計算各時間點的剩余百分比，結果見圖4。如圖所示，經過6 h、37 ℃孵育后，在胃液、肝液、大腸及其內容物、小腸及其內容物的相對剩余百分率分別為(93.05±0.84)%、(95.38±0.7)%、(94.58± 0.424)%、(84.06±0.212)%。結果表明，DFB在胃液、肝液、大腸及其內容物中基本穩定，但在小腸及其內容物中有一定的降解(約16%)。

3 討 論

口服藥物在胃腸道環境下的穩定性考察，是新藥開發的重要研究內容，而藥物在胃腸道中的含量變化是關鍵環節。本試驗采用液相色譜法，考察了DFB在人工胃/腸液、腸道菌群及生物樣品中的穩定性。結果發現，DFB在空白胃液和人工胃液中有一定降解，但DFB的剩余百分比均在90%以上，總體表現出穩定趨勢。DFB在空白腸液和人工腸液中發生降解(約20%)，表明在堿性或胰蛋白酶存在的條件下，DFB相對于在酸性或胃蛋白酶存在的環境中更易降解。此結果與前期的研究結果相似，左三齡等[27]研究發現，DFB在酸性介質中穩定性較堿性條件下更為穩定。

鑒于進入腸道的藥物會受到腸道菌群的影響，本研究另外測定DFB在SD大鼠腸道菌群中的穩定性。結果顯示，DFB在SD大鼠腸道菌群中表現出穩定的趨勢，說明腸道菌群對DFB幾乎沒有代謝作用。為了使試驗條件更加接近生物體內代謝環境，本研究檢測了DFB在生物樣品中的穩定性，發現DFB在大鼠肝臟、大鼠胃液、大鼠大腸及內容物中都表現出穩定的趨勢，而在大鼠小腸及內容物中有降解(約16%)，這與上述DFB在空白腸液和人工腸液中的結果較為一致。

綜上所述，DFB在堿性及胰蛋白酶存在的條件下有一定的降解，表明DFB在動物體內的代謝主要發生在小腸。

該研究結果表明，DFB在開發口服制劑時需要進行特殊的處理來防止DFB在體內的降解，同時也為DFB的后續研究提供數據基礎。