冀東稻區基于低溫復合菌系HT20的秸稈腐解因素研究

孫建平，劉雅輝，馬 佳，趙子婧，陸 垚，何宗均，呂晶晶

(1.河北省農林科學院 濱海農業研究所，河北唐山 063299；2.河北省農林科學院遺傳生理研究所，石家莊 050051；3.天津市農業科學院，天津 300000)

水稻秸稈含有大量有機質及植物生長所必須的氮、磷、鉀及其他微量元素，是農田養分循環利用的基礎[1-2]。冀東濱海地區水稻種植面積約為6.67萬hm2，秸稈產生量約為65萬～70萬t，由于缺乏秸稈高效利用技術，大多數被直接焚燒，不僅造成大量生物質資源的浪費和大氣污染，而且對土壤生態系統造成嚴重的破壞[3]。近年來，當地政府大力提倡秸稈直接還田，但由于北方秋冬季節氣溫偏低且持續時間長，秸稈粉碎后在田間自然狀態下腐熟慢，不利于田間耕作和農藝操作[4-6]，特別是自然狀態下腐熟時恰逢水稻緩秧分蘗期，土壤中大量CH4、N2O、CO2和有機酸產生，嚴重影響水稻秧苗根系的生長[7]，秸稈降解慢、不充分是制約該區域秸稈還田的關鍵因素，限制了北方水稻秸稈還田的大面積推廣應用。

目前，添加腐熟劑是解決秸稈快速腐解的主要措施[8-9]。研究表明腐熟劑促進秸稈分解[10]，減少溫室氣體排放[11]，有利于改良土壤理化性狀[12]和微生物群落活性與多樣性的提高[13-14]，增加產量[12]，并且還可以固定鉻[15]。但秸稈還田條件下腐熟劑與土壤質地間響應不同[16]，水稻田干濕交替，需要厭氧和好氧微生物群落的交替作用,市面上的大多數產品以好氧微生物居多，加上低溫環境下微生物難以生長，活性降低，田間效果不理想，因此，亟需尋求在低溫條件下可以啟動的微生物產品，用于北方水稻秸稈直接還田。

低溫復合菌系因其可以實現腐解的快速啟動，并產生大量有益微生物，引起了各類學者的廣泛關注，目前較多應用于玉米秸稈及牛羊雞豬糞等多種廢棄資源的堆肥中[17-19]，而在北方水稻秸稈直接還田應用中研究很少。農田秸稈綜合利用課題組前期從冀東濱海稻區水稻秸稈還田土壤中通過低溫脅迫、富集篩選、拮抗試驗、組合構建了由白蟻菌、長柄木霉、芬萊氏鏈霉菌、葡萄球菌等組成的低溫復合菌系HT20，并初步應用于冀東稻區水稻秸稈還田，實現了低溫環境下秸稈的快速腐解。為了更好地發揮其作用，本研究以低溫復合菌系HT20為研究對象，采用響應曲面法(response surface method，RSM)，通過室內培養和大田微區試驗，研究HT20添加量、尿素添加量、溫度和含水率及其互作對秸稈腐解率的影響，預測HT20作用下秸稈的最佳腐解條件，并與市面常用的4種秸稈腐熟劑進行比較，分析其對秸桿的腐解程度和土壤的肥力影響，闡釋其對水稻秸稈的腐解效果和適應性，為低溫復合菌系HT20應用水稻秸稈還田提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與概況

研究區域位于河北省唐山市曹妃甸區濱海現代農業綜合試驗站(39°16′31″N，118°27′5.14″E)，距渤海約4.5 km，海拔2.5～4.3 m，該地區屬于東部季風區暖溫帶半濕潤季節型近海大陸性氣候，具有光照充足，降水集中，雨熱同期，四季寒暖干濕分明等氣候特征[20]。2010—2019年月平均氣溫12.3 ℃，蒸發量平均為1 969 mm，冬季盛行偏西北風，春、夏季盛行偏南和東南風，秋季多偏西南風。年降水量為635.9 mm，主要集中在7—8月份。

1.2 試驗材料

盆栽試驗的土壤來源于長期種植水稻的土壤，土壤類型為鹽漬型濱海粘壤土，0～20 cm耕層土壤理化性質：電導率為602 μS·cm-3，pH為8.16，有機質5.45 g·kg-1，速效磷24.35 mg·kg-1，速效鉀102.71 mg·kg-1，速效氮為30.56 mg·kg-1，體積質量為1.45 g·cm-3。還田秸稈選用前茬水稻所產生的秸稈，水稻秸稈的養分含量：C/N 67，全氮為0.68%，全磷為 0.13%，全鉀為1.34%，選用河北省農林科學院濱海農業研究所自研水稻品種‘墾育979’。供試腐熟劑分別為低溫復合菌系HT20(自研)；農富康(農富康生物科技有限公司)；還田寶(北京百豐天下生物科技有限公司)；春雨(蘇州農旺生物科技有限公司)；啟明(湖北啟明生物工程有限 公司)。

1.3 試驗設計與樣品采集

1.3.1 低溫復合菌系HT20高效腐解條件優化 以溫度、含水量、HT20添加量、尿素添加量為試驗因素，各因素設置3個試驗水平，采用Design-expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken方法進行設計(表1)，其中有5個重復中心點，共29個處理，各處理均設置5個重復。在已滅菌的250 mL錐形瓶中加入秸稈5.000 g，然后按照設計加入相應量的HT20和尿素，采用無菌水調節含水率，封口膜封口，置于相應溫度的恒溫培養箱中避光培養。30 d后，取出錐形瓶測定秸稈腐解率。

表1 試驗因素與試驗水平

1.3.2 不同腐熟劑對水稻秸稈還田土壤和秸稈腐解效果 設置未施用腐熟劑秸稈直接還田為對照(CK)，施用低溫復合菌系HT20秸稈還田(低溫復合菌系)、施用農富康秸稈直接還田(農富康)、施用還田寶秸稈直接還田(還田寶)、施用春雨秸稈直接還田(春雨)、施用啟明秸稈直接還田(啟明)，共6個試驗處理。建立大田微區，每個微區規格為600 cm×200 cm×60 cm，其中擺滿塑料桶(規格56 cm×58 cm)，桶四周及底部扎孔增加土壤的透氣與水分的流出，桶與桶之間的縫隙用土填滿，每個處理安排在一個微區中，3個微區為3次重復，防止微區之間相互污染，降低試驗誤差。試驗采用尼龍網袋填埋法，尼龍網袋規格為長×寬=50 cm×45 cm，孔徑為0.178 mm，以隔離土壤。供試稻草剪切至約5 cm放入尼龍網袋中，用尼龍線綁好袋口，水稻秸稈還田量按10 500 kg·hm-2算，每袋裝稻草262 g，于2019年11月23日施用腐熟劑處理每袋加入1 g與秸稈進行混勻后埋入塑料桶中土下15～20 cm處，未施用腐熟劑直接埋入。于2020年5月中旬移栽水稻秧苗，插秧密度按照30 cm×16 cm，每穴5株。各處理全生育期田間管理與常規田間管理措施。

各處理于秧苗移栽后30 d、90 d和150 d時取5袋樣品，清理干凈尼龍網袋上的土粒，烘干，測定秸稈的殘留量，計算秸稈腐解率。土壤樣品在拔去水稻根后，自主根系位置自上而下(從表面至塑料桶底，約20～25 cm深)，用土鉆(鉆頭直徑為3.8 cm)，取下約500 g土壤樣品，帶回實驗室，200 g新鮮的土樣用于測定微生物，300 g土樣在通風處自然風干，去根系雜質，過篩，用于測定土壤的化學性質。

1.4 測定方法

土壤微生物采用經典的稀釋平板法[21]，其中細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基；真菌采用PDA培養基；放線菌采用改良高氏1號培養基、有機質含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定；速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用原子吸收分光光度計法測定[22]。

秸稈腐解速率=(原始秸稈質量-剩余秸稈質量)/t

秸稈殘余率=剩余秸稈干質量/原始秸稈干質量×100%

為進一步比較不同處理秸稈腐解動態，本研究用修正后的Olson指數衰減模型來擬合[23]，其形式為：y=x/x0=e-kt

公式中，y為秸稈腐解殘余率(%)；x0、x分別為腐解開始時和腐解后t時的秸稈量(kg)；k為腐解速率常數，k越大，分解速度越快。

根據公式y=x/x0=e-kt中的k來計算秸稈分解50%(T50)和95%(T95)所需的時間(d)，計算公式為：T50=ln0.5/(-k)，T95=ln0.05/(-k)。

1.5 數據分析

采用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken中心組合試驗設計及回歸方程方差分析，采用 Excel 2017進行原始數據的整理與作圖；采用SPSS 22.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)比較不同處理間差異。

2 結果與分析

2.1 回歸模型的建立

對影響秸稈腐解率的4個關鍵因素進行試驗，利用Design-Expert軟件中Box-Behnken 設計了29組試驗(表2)，其中有5個重復中心點，結果顯示腐解率為7.69%～62.27%。對數據進行多元回歸擬合獲得腐解率的二次多項式回歸模擬方程為：R=-25.872 35+0.479 81A+ 0.863 86B+16.344C-63.606 67D+ 0.015 573AB-0.085 333AC+17.766 67AD+0.06BC+1.422BD+5.5CD+0.000 752 593A2-0.006 432 27B2-17.000 67C2-1 696.066 67D2。式中，R為秸稈腐解率(%)，A為溫度(℃)，B為含水率(%)，C為尿素添加量(mg)，D為HT20添加量(g)。

表2 Box-Behnken 設計的不同試驗處理及其響應值

對秸稈腐解率的模擬方程求極值得知，當溫度為5 ℃，含水率為80.76%，HT20添加量為 0.04 g，尿素添加量為0.6 mg時，秸稈的腐解率可達到22.6%；當溫度為10.86 ℃，含水率為90%，HT20添加量為0.080 g，尿素添加量為 0.600 mg時，秸稈的腐解率可達到36.7%；當溫度 20 ℃，含水率為88.59%，HT20添加量為 0.080 g，尿素添加量為0.300 mg時，秸稈的腐解率可達到64.09%。表明低溫復合菌系HT20在 5～20 ℃可以腐解秸稈。

2.2 回歸模型的方差分析和方程回歸系數的顯著性檢驗

為了檢驗方程的有效性，對腐解率的數學模型進行方差分析(表3)，模型的P值小于 0.000 1，模型極顯著。模型方程失擬項P值為 0.286 3，差異不顯著。說明秸稈腐解率與溫度、含水率、尿素添加量、HT20添加量之間具有高度的相關性(R2=0.955 1)，校正相關系數AdjR2為 0.910 1，說明腐解率的模擬模型與實際情況高度吻合。

從回歸系數的顯著性檢驗(表3)可以看出，4因素的顯著性概率為溫度≈含水率

表3 回歸模型的方差分析和回歸系數顯著性檢驗

2.3 響應曲面結果分析

由溫度、含水率、HT20添加量和尿素添加量4因素交互作用對秸稈腐解率影響的三維空間響應曲面圖(圖1)可以形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用。從溫度和含水率交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-A)，當HT20添加量為0.050 g，尿素添加量為0.500 mg，若含水率固定時，腐解率隨溫度升高而增加，若溫度固定時，腐解率隨含水率增加而增加，變化幅度大。通過顏色可以看出溫度與含水率交互作用對秸稈腐解率影響顯著。

溫度和HT20添加量交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-B)，當含水率65%，尿素添加量0.500 mg時，若HT20添加量固定時，腐解率隨溫度升高呈增大的趨勢，且變化幅度明顯；若溫度固定時，腐解率隨HT20添加量的增加呈先增加后降低的趨勢，并出現了拐點。通過顏色可以看出溫度與HT20添加量交互作用對秸稈腐解率影響顯著。

HT20添加量和尿素添加量交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-C)，當溫度 12.5 ℃，含水率65%，若HT20添加量固定時，腐解率隨尿素添加量呈先增加后降低的趨勢，變化比較緩慢，若尿素添加量固定時，腐解率隨HT20添加量呈先增加后降低的趨勢，變化比較緩慢，并出現了拐點。HT20添加量和尿素添加量交互作用對秸稈腐解率影響不顯著。

HT20添加量和含水率交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-D)，當溫度12.5 ℃，尿素添加量為0.500 mg，若含水率固定時，腐解率隨HT20添加量呈先增加后降低的趨勢，并出現了拐點；若HT20添加量固定時，腐解率隨含水率的增加而增加，變化幅度較明顯。HT20添加量與含水率交互作用對秸稈腐解率影響不顯著。

2.4 HT20對冀東稻區還田秸稈腐解效果的影響

由圖2-A可知，秸稈腐解速率隨時間的變化呈現先增加后降低的趨勢。與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，在秧苗移栽30 d，低溫復合菌系HT20增加秸稈的腐解速率28.31%～81.46%；在秧苗移栽90 d，低溫復合菌系HT20增加秸稈的腐解速率20.10%～35.11%；在秧苗移栽150 d，低溫復合菌系HT20增加秸稈的腐解速率31.68%～53.61%。由圖2-B可知，與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，秸稈分解50%所需時間提前17.62～42.44 d，秸稈分解95%所需時間提前50.12～183.41 d，表明HT 20可以加快冀東稻區還田秸稈的腐解速度。

2.5 HT20對水稻秸稈還田土壤的影響

通過對秧苗移栽30 d和150 d的土壤進行速效磷、速效鉀、有機質、細菌、真菌和放線菌數量的測定(圖3)，采用雷達圖對多個指標進行數值分析，面積越大的處理，就表示指標值越好。結果顯示，低溫復合菌系HT20在5種腐熟劑中效果是較好的。與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，低溫復合菌系HT20增加了速效磷5.44%～71.49%、速效鉀19.62%～56.23%、有機質 6.86%～57.27%、細菌21.29%～76.14%、真菌 1.57%～64.49%、放線菌15.15%～76.14%，表明冀東稻區水稻秸稈還田配施低溫復合菌系HT20可以增加土壤的養分含量和微生物數量。

3 討論與結論

秸稈還田是當今世界上普遍重視的一項培肥地力的增產措施，在杜絕秸稈焚燒所造成的大氣污染的同時還有增肥增產作用[24-26]。秸稈還田的效果和秸稈的腐爛速度有直接關系。秸稈腐爛越快對土地的效果越好，而秸稈腐爛的速度除了與自身條件有關以外，還與土壤質地[27]、水熱條件[28]和外源氮[29]有很大關系。本研究通過響應曲面法RSM分析得出溫度、含水率和低溫復合菌系HT20添加量是影響秸稈腐解率的關鍵因素，原因可能為溫度和含水率通過影響土壤中一些微生物群落的生長繁殖和生理機能，低溫復合菌系HT20通過直接增加微生物的種類和數量，影響秸稈分解速率。低溫復合菌系HT20添加量與溫度、含水率的交互作用對秸稈腐解率影響顯著，這與以往單一因素對秸稈腐解的研究不同，本研究可同時考慮影響因素單獨作用及交互作用對秸稈腐解率影響的顯著性。從響應曲面圖(圖1)中，低溫復合菌系HT20添加量與溫度、含水率的交互作用對秸稈腐解率的影響過程中，隨著HT20添加量的增加，秸稈腐解率出現了拐點，說明HT20添加量與秸稈的腐解效果不是完全成正比，拐點即為最佳添加量。此外，HT20添加量與尿素添加量交互作用對秸稈腐解率影響不顯著。因此，在施用HT20時不需額外施用尿素，施用方法簡單，這與大多數腐熟劑不同。在我國的北方地區，冬季非常寒冷，微生物活性較低，秸稈2 a不能實現完全腐化，對于下年種植水稻十分不利。本研究從本地水稻秸稈還田土壤中篩選出可在5 ℃生長的纖維素分解菌株，通過低溫脅迫、富集篩選、拮抗試驗、組合構建了主要由白蟻菌、長柄木霉、芬萊氏鏈霉菌、葡萄球菌等組成的低溫復合菌系HT20，并應用水稻秸稈還田研究中，與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，低溫復合菌系HT20不僅提高秸稈的腐解速率，縮短腐解時間，同時還增加土壤的養分和微生物數量。利用Design-Expert軟件對秸稈腐解率的數學模型求極值得知HT20在5～10 ℃時候的腐解率可達22.6%～36.7%，說明低溫復合菌系HT20可以在低溫條件下氧化外源物質，降低微生物的啟動溫度，在水稻秧苗移栽前即可完成秸稈部分分解，釋放養分，減少對水稻根系生長的影響。依據該地區氣候條件可知，冀東稻區在11月左右水稻收獲后施用低溫復合菌系HT20直接還田，并進行適量灌水處理，可以滿足秸稈腐解需要的溫度、水分和微生物，還可以消滅越冬害蟲，為解決冀東稻區冬季秸稈原位還田腐解困難問題提供技術支撐。