肺浸潤性腺癌組織中miR-153-3p和PRDM2的表達

曲靚靚，朱麗娟，楊薇

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000)

肺浸潤性腺癌是發生于肺泡上皮細胞的惡性腫瘤。病變的形成和進展與多種遺傳物質及細胞因子的改變有關，其中包括多種DNA、RNA及蛋白等[1]。正性調控域鋅指蛋白(PRDM2)是鋅指蛋白家族中的成員，具有組蛋白甲基轉移酶活性和抑制轉錄因子調控的功能。近年研究顯示PRDM2在惡性腫瘤中的表達升高，是腫瘤形成的重要促進因子[2]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年關注到的與多種腫瘤形成相關的基因，是19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，通過與目標基因的3’UTR結合調節生物功能[3]。課題組前期進行生物信息學分析，選擇與肺浸潤性腺癌密切相關，且文獻中尚未見報道的微小RNA-153-3p(miR-153-3p)進行研究，同時應用TargetScan數據庫預測到PRDM2可能是miR-153-3p的靶因子?；诖耍緦嶒炦M行實驗設計，檢測肺浸潤性腺癌組織中miR-153-3p的表達，分析其臨床及預后意義，探討miR-153-3p與PRDM2的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年4月至2017年12月確診為肺浸潤性腺癌的患者56例作為研究對象。納入標準：(1)患者均行手術治療，術后均具有明確的病理診斷，符合WHO中的標準；(2)首次確診；(3)臨床、病理及隨訪資料齊全。排除標準：(1)診斷有異議者或病理診斷中伴有其它異源性成分者；(2)肺手術前患者行放、化療者；(3)隨訪資料不全或家屬不同意觀察者。本組中男26例，女30例，年齡31～79歲，平均年齡(60.1±7.6)歲。其中有胸膜累犯15例，無胸膜累犯41例，腫瘤最大徑0.9～6.7cm，平均(3.2±0.9)cm。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫瘤邊緣>3 cm的正常肺組織作為對照組，均留取術后新鮮組織(-80 ℃冰箱凍存)及石蠟包埋組織。研究經醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》中的相關要求，患者或家屬已簽知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量PCR法檢測miR-153-3p的表達

應用實時熒光定量PCR法(qRT-CPR)檢測miR-153-3p的表達。基于新鮮組織進行實驗，采用TRizol(美國Invitrogen公司)提取總RNA。引物由北京三博遠志公司合成。miR-153-3p上游引物：5'-GTCAATTGAGCACGTGGCCAC-3'；下游引物：5'-GACGTACGGACTGACGGACCAC3'。以U6為內參，引物上游：5'-GGAAGTAGCACCTGATTAGC-3＇下游：5'-TTGGAATACGAATTGGCCG-3'。逆轉錄法合成cDNA(試劑盒為北京百奧萊博公司)。PCR反應的程序設定：95 ℃預變性30 s；變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個循環，充分延伸72 ℃ 5 min。結果以2-ΔΔCt表示。PCR儀為美國伯樂公司生產。

1.2.2 免疫組化法檢測PRDM2的表達

應用免疫組化SP法檢測肺浸潤性腺癌組織中PRDM2的表達。PRDM2為濃縮液，購自江蘇睿贏生物技術公司，二抗和DAB購自北京中杉金橋生物技術公司。術后標本常規固定、脫水汲石蠟包埋后，切取4 μm切片。先按不同比例對PRDM2的濃縮液行預實驗，選擇預實驗中PRDM2配比濃度為1∶120顯色最理想的濃度用于正式實驗。正式實驗均由同一病理科技師操作，嚴格按說明書手工操作，一次性完成，DAB顯色。PRDM2的陽性部位是細胞質和(或)細胞膜，選擇5個400倍視野(熱點區)進行觀察，計算陽性率的平均值。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 兩組中miR-153-3p表達的比較

兩組中miR-153-3p的表達量差別有統計學意義，即觀察組中miR-153-3p的表達量明顯低于對照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組中miR-153-3p的表達量的比較

圖1 miR-153-3p表達(qRT-PCR法)

2.2 miR-153-3p在不同臨床病理特征分組中表達的比較

MiR-153-3p在不同腫瘤最大徑、肺膜累犯分組的表達中差異有統計學意義(P<0.05)。而在不同性別和年齡的分組中差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 miR-153-3p在不同臨床病理特征分組中表達的比較

2.3 miR-153-3p 表達的生存分析

肺浸潤性腺癌患者均進行術后3年(36個月)的隨訪，隨訪方式有電話隨訪、門診隨訪及家訪，截止時間點為2020年12月31日。其中存活26例，死亡27例，失訪3例。死亡患者確診后的生存時間為6～36個月，中位生存時間為22個月。以miR-153-3p表達的平均值(1.36)為臨界值分組行K-M生存分析，結果顯示miR-153-3p的表達與預后相關(χ2=5.67，P=0.036)，即miR-153-3p低表達患者的預后差，見圖2。

圖2 miR-153-3p表達的生存分析

2.4 觀察組中miR-153-3p與PRDM2的相關性

TargetScan數據庫檢索顯示miR-153-3p與PRDM2具有可能結合的位點，見表3。免疫組化方法檢測到PRDM2的陽性率范圍是10%～70%，平均為41.1%，見圖3。相關分析顯示miR-153-3p與PRDM2呈負相關性(r=-0.69，P=0.013)，見圖4。

表3 TargetScan數據庫檢索顯示miR-153-3p與PRDM2具有可能結合的位點

圖3 PRDM2的表達(免疫組化SP法，200×)

圖4 miR-153-3p與PRDM2的相關性

3 討 論

肺腺癌是起源于肺上皮細胞形成的腫瘤，最肺組織中最常見的非小細胞癌，其發生機制復雜，其形成與多種分子生物學通路表達異常有關。PRDM2 是近年關注的與腫瘤形成相關的因子，也稱為 Blimp2，主要通過募集轉錄共抑制因子進而調節靶基因的轉錄[4]。PRDM2最早期的研究認為PRDM2是調節機體免疫功能中B淋巴細胞向漿細胞分化的因子，進一步的研究發現，PRDM2可通過降低細胞的增殖和促進T細胞的凋亡，維持T細胞之間的平衡[5]。近年學者發現PRDM2可能具多種生物學作用，尤其是發現PRDM2可以調控腫瘤細胞增殖，并認為這可能是肺浸潤性腺癌病變形成的經典途徑[6-7]。研究顯示PRDM2異常表達是腫瘤進展的重要調控因子，可能與腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移有關[8]。PRDM2在惡性腫瘤的病變組織高表達，具有癌基因樣的作用[9-10]。但是其起作用需要更多的介導因子。研究認為PRDM2的上游調控因子較多，包括miRNAs、長鏈非編碼RNA、環狀RNA及經典的蛋白調控通路[5]841-846。miRNAs的種類繁多。課題組在實驗前進行篩查，選擇出miR-153-3p進行實驗研究，同時也發現miR-153-3p異常表達對腫瘤細胞增殖有一定的調節作用[11-12]。miR-153-3p在正常人體組織中具有穩定的表達狀態，而在上皮源性惡性腫瘤中常伴有miR-153-3p表達的下調[13]。miR-153-3p在腫瘤中的作用可能與抑癌基因的作用相似，miR-153-3p 對下游多種因子的靶向作用可能是其調節腫瘤形成和進展的重要方式[14-15]。

本研究結果顯示肺浸潤性腺癌中miR-153-3p的表達下調，提示miR-153-3p低表達是肺腺癌形成的重要分子事件。miR-153-3p在肺腺癌形成過程中發揮抑癌基因樣的作用。結果顯示MiR-153-3p在不同腫瘤最大徑、肺膜累犯分組的表達中差別有統計學意義，提示miR-153-3p 與腫瘤的生長及周圍組織累犯相關，也提示miR-153-3p異常表達與腫瘤的生物學行為相關，miR-153-3p低表達時具有較高的侵襲潛能及生長潛能[16-18]。生存分析發現miR-153-3p的表達與預后有關，提示miR-153-3p可能對判斷預后有一定價值，即miR-153-3p低表達的患者生存時間短，預后差。這種預后判斷的具體價值需要后續臨床進行多中心、大樣本的研究來證實，并進一步確定其判斷的臨界值。生物信息學顯示miR-153-3p和PRDM2具有結合的位點，相關分析顯示兩者具有負相關性，提示兩者可能具有靶向調控作用。但是此種作用需要基礎實驗的雙熒光素酶報告基因等實驗來進一步證實。李冠軍等[4]58-63通過在膀胱癌中研究，發現miR-153與PRDM2具有靶向作用，其能通過JAK/STAT信號通路影響膀胱癌的侵襲和遷移，此研究與研究的結論具有相似性。miR-153-3p異常表達可以活化PRDM2的表達，目前認為PRDM2在體內有2種啟動子，外部啟動子產物為PRDM2，但是當其甲基化后則影響后續的轉錄作用[8]2991-3002。PRDM2作為一種癌基因，可誘導腫瘤細胞增殖活性的改變，介導同質型粘附能力下降，細胞運動能力增強，侵襲和遷移能力增強[19]。Sun等[20]通過在膠質瘤中研究miR-153-3p的表達特征，發現miR-153-3p可能通過調控Bcl-2介導腫瘤的凋亡作用。miR-153-3p還可能通過對下游FOXO3等基因的靶向調控發揮作用[16]105126。因此miR-153-3p的作用方式及作用途徑復雜，但是miR-153-3p調控的具體作用及在肺腺癌中的作用尚需要更多基礎實驗來進一步明確[21-22]。

綜上所述，MiR-153-3p在肺浸潤性腺癌中的表達下降，其與病變的形成和進展有關。MiR-153-3p與PRDM2可能具有協同負向作用。術后檢測MiR-153-3p的表達可能對判斷預后有一定作用。