親環素A、基質金屬蛋白酶-9在根尖肉芽腫及根尖囊腫中的表達

馮曉娜，付穎

(錦州醫科大學附屬第二醫院，遼寧 錦州 121000)

根尖周炎是根尖周組織抵御侵入和感染牙髓的微生物及其釋放產物過程破壞了根尖微生態平衡所致的疾病。由于長期激惹和機體自身防御機制不足，致使根尖周結締組織及骨組織破壞性吸收。根尖周病的骨缺失可能是細菌及表面成分的間接作用后果[1]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種酶活性中心，結合游離狀態下的鈣鋅離子而激活以后發揮蛋白分解功能，具有高度恒定性，廣泛存在于全身的結締組織中，參加水解幾乎細胞外基質的全部成分，其中也包括骨組織[2]。MMP-9是MMPs家族中的明膠酶，也稱IV型膠原酶，除了可水解自然的IV、V、VII、XI膠原外，也可以水解與某些分子結合后的I、II、III型膠原明膠，還能在某種程度上降解纖維連接蛋白、彈力蛋白。骨膠原是根尖周骨組織的重要組成部分，位于骨表面的膠原層降解以后，骨的脫礦和吸收才能相繼發生，MMP-9通過降解骨膠原而在骨吸收中起到了不可忽視的作用，MMP-9還可以降解細胞外基質輔助骨組織的吸收，多數研究表明MMP-9的表達量與根尖周炎的骨吸收量有關[3]。親環素(cyclophilins，Cyps)是一類具有高度保守性的多功能蛋白家族，在真菌、細菌、植物、昆蟲和哺乳動物中廣泛存在。目前的研究發現親環素有 16個成員，家族高度保守性表現為其疏水區域的氨基酸排列次序近乎相同。CyPA擁有肽脯氨酰順反異構酶功能。CyPA可以促進絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase，MAPK)信號通路中的p38、MAPK 和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNKs)的活化[4-5]。CyPA通過與受體胞外基質金屬蛋白酶誘導劑(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)結合，在類風濕關節炎、腹主動脈瘤等多種疾病中促進MMP-9表達增多活性增強。已有研究證實，CyPA的配體EMMPRIN在牙周組織成骨細胞、破骨細胞表面高表達[6]，MMP-9在破骨細胞功能的初級階段可能已經起到一定的作用，CyPA可能通過與配體結合后，影響MMP-9的表達導致根尖周炎的發生。本實驗旨在通過檢測根尖周肉芽腫及根尖囊腫中CyPA及MMP-9的表達情況，從而探討CyPA及MMP-9表達與根尖周骨吸收的聯系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

2013年10月至2015年5月在錦州醫科大學附屬第二醫院就醫的經根尖手術或牙拔除術的根尖周病損組織32例。患者年齡在18～65歲之間，平均48歲，男20例，女12例。納入標準：(1)受試者均口腔無其他疾病；(2)無其他全身系統性疾病；(3)3個月內沒有服用抗生素和或其他激素類藥物；(4)非孕婦；(5)牙髓無活力，X線檢查診斷為根尖肉芽腫或根尖囊腫。不符合納入標準者，予以排除。8例因正畸需求拔除的健康前磨牙牙髓作對照組。入選患者已然明確了研究目的，自愿進行實驗研究，并簽署了知情同意書。本研究經錦州醫科大學倫理委員會同意備案。

1.2 根尖周骨吸收面積測量

應用平行線投照技術在保持放射條件不變前提下進行X線拍攝，每次均64 kV，6.5 mA，曝光時間0.4 s，距離5 cm，進行初步鑒別。根肉芽腫X線片示圍繞根尖部的圓形或橢圓形病變范圍較小界線清楚的透射影。根尖囊腫X線片示患牙根尖病變范圍略大透射區，邊界清楚，周圍有致密骨白線圍繞。另一名研究者進行盲法測量，將全部X線片轉換成為BMP圖片格式，并應用Image-Pro plus 6.0系統測量是病變區病損骨密度值均值。

1.3 CyPA及MMP-9蛋白檢測

取正常牙髓根尖1/3作為對照組，根尖手術后取出組織為實驗組，常規脫水石蠟包埋切片，HE染色后組織學觀察。免疫組化檢測CyPA及MMP-9蛋白表達。常規切片脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗，兔抗人CyPA隆抗體稀釋濃度為1∶300，兔抗人MMP-9單克隆抗體稀釋濃度為1∶400，于濕盒內4 ℃冰箱中孵育16～20 h，滴加二抗，于37 ℃恒溫水域箱中孵育30 min，DAB染色，蘇木素復染，常規酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS替代一抗孵育切片作為陰性對照。CyPA及MMP-9 陽性表達為細胞質、細胞膜或細胞核中出現棕黃色顆粒。用倒立式熒光顯微鏡拍攝于400倍下隨機選取5個視野，用Image-Pro plus 6.0圖像處理系統計每張切片上CyPA、MMP-9的蛋白平均吸光度值(A值)。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 CyPA、MMP-9蛋白表達水平

實驗組CyPA和MMP-9表達量顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2～5、表1。CyPA在實驗組與對照組的組間表達中差異明顯(F=73.400，P<0.05)，MMP-9在實驗組表達明顯高于對照組(F=33.644，P<0.05)；CyPA在根尖肉芽腫中表達多于根尖囊腫，差異具有統計學意義(P<0.05)，但MMP-9根尖肉芽腫組與根尖囊腫組并無明顯差異性。

圖1 正常牙髓(HE，400×)

圖2 CyPA在根尖肉芽腫的表達(DAB，400×)

圖3 CyPA在根尖囊腫的表達(DAB，400×)

圖4 MMP-9在根尖肉芽腫的表達(DAB，400×)

圖5 MMP-9在根尖囊腫的表達(DAB，400×)

表1 在根尖周炎患者與對照組患者CyPA、MMP-9

2.2 根尖周病根尖區CyPA蛋白與MMP-9蛋白的相關性分析

對于根尖周病患者根尖區CyPA蛋白與MMP-9蛋白的相關性分析，統計散點圖，經統計學相關性分析，根尖周病CyPA蛋白與MMP-9蛋白平均吸光度值表達呈正相關(r=0.506，P=0.003)，在α=0.01水平上顯著相關，見圖6。

圖6 根尖周病患者根尖區CyPA蛋白與MMP-9蛋白表達的相關性分析

2.3 CyPA、MMP-9蛋白表達與根尖周炎病損區骨密度的相關性分析

Pearson相關性分析顯示CyPA蛋白吸光度值和根尖周骨密度值呈負相關關系(r=-0.410，P< 0.05)，見圖7；MMP-9 蛋白吸光度值和根尖周骨密度值呈負相關關系(r=-0748，P< 0.05)，見圖8。

圖7 CyPA蛋白表達與根尖周骨密度的相關性分析

圖8 MMP-9蛋白表達與根尖周骨密度的相關性分析

3 討 論

根尖周炎主要是由根管感染蔓延至根尖引起的局部炎癥性骨破壞疾病，此過程涉及多種細胞及其釋放因子的參與，在根尖周病變中有多種細胞參與了炎癥反應如淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、漿細胞等，也有研究發現[7]

CyPA多表達于血管內皮細胞、淋巴細胞上，集中于血管壁并通過介導血管內皮細胞遷移和積聚使大量炎性細胞增生，繼而血管重建，而毛細血管增生、淋巴細胞及單核細胞浸潤是根尖肉芽腫的主要病理表現，而根尖周炎的另一重要臨床表現是骨的吸收，破骨細胞是根尖周炎骨吸收的重要細胞，大量實驗已經證實MMP-9是破骨細胞成熟的表面標志物之一[8]，M-CSF，RANKL可以誘導破骨細胞成熟并表達MMP-9[9]，RANK表達升高可以促進MMP-9的表達使破骨細胞活化[10]，MMP-9抑制后，破骨細胞遷移功能減弱[11]。

CyPA和MMP-9的共同作用在口腔領域研究極少，在類風濕性疾病、心血管疾病、腫瘤等領域有較多的研究。在類風濕性關節炎，細胞外CyPA與其膜受體EMMPRIN相互作用促進MMP-9的表達及巨噬細胞粘附，近而破壞軟骨與骨組織[12]，表明CyPA和MMP-9的協同作用在軟骨和骨的降解中起重要作用。本實驗的結果與之一致，CyPA和MMP-9的蛋白表達在根尖周炎的發展中起協同作用。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)[13]發展中CyPA可促進單核細胞分泌炎癥因子IL-6，誘導單核細胞遷移趨化，CyPA通過NF-кB-MAPK炎癥信號通路增強單核細胞表達的MMP-9活性，As是血管壁對各種損害過度應答引起的一系列慢性炎癥過程。PCR檢測喉癌中EMMPRIN及MMP-9 mRNA表達量相較于良性者明顯上調，且MMP-9 mRNA的相對表達量與EMMPRIN mRNA的相對表達量均成正相關關系[14]，也提示腫瘤骨轉移及骨破壞過程與三者的作用相關。在口腔專業領域，初次有學者發現了CyPA參與了牙周病的發生與發展[15]，隨后國內有學者初次在根尖周炎組織中檢測到了CyPA的存在[16]。

本實驗中可見CyPA大量聚集于淋巴細胞、上皮細胞、血管內皮細胞，少見于巨噬細胞和漿細胞，MMP-9大量表達于主要表達在淋巴細胞、單核巨噬細胞，少見漿細胞，CyPA和MMP-9在慢性根尖周炎組織同時高表達于單核細胞，提示CyPA促進根尖周炎中MMP-9的表達，這一過程可能一方面通過CyPA通過NF-кB-MAPK炎癥信號通路促進單核細胞表達MMP-9進一步發揮促炎作用，CyPA配體EMMPRIN高表達于破骨細胞表面，CyPA表達升高可能刺激根尖周組織表達TNF-α，IL-6，IL-1，IL-11而后促進RANKL的激活發揮對根尖周炎骨吸收的促進作用，RANKL，IL-1、IL-6、IL-11、TGF-α可以使MMP-9表達升高活化破骨細胞，趨化單核細胞，所以推測另一方面CyPA在與配體EMMPRIN 結合后可能通過細胞因子TNF-α，IL-6，IL-1，IL-11，RANKL的作用使MMP-9協同表達，實驗中MMP-9在根尖周炎組織的表達顯著高于對照組，提示MMP-9在根尖周炎的發展中起到促進作用，這一作用的發揮可能是通過M-CSF，RANKL，IL-1、IL-6對MMP-9的促進使破骨細胞活化，上調中性粒細胞表達，發揮骨吸收作用。CyPA和MMP-9在根尖周肉芽及囊腫的骨吸收中所起到的協同表達可能通過單核細胞、破骨細胞發揮作用，明確調節機制仍需更多研究加以說明。臨床中慢性根尖周炎癥主要表現為根尖肉芽腫和根尖囊腫，臨床中根尖肉芽腫可能最終發展為根尖囊腫，而兩者之間的鏡下的主要鑒別在于是否存在復層鱗狀上皮，CyPA在上皮細胞表達提示CyPA可能對根尖肉芽腫向根尖囊腫的轉化起促進作用。

綜上所述，本研究中CyPA和MMP-9在根尖周炎中的表達顯著高于正常牙髓組織，CyPA和MMP-9的表達與根尖區骨密度值呈負相關，兩者不僅參與根尖炎癥的發生過程，而且與根尖骨吸收可能密切相關。CyPA和MMP-9與全身的炎癥性疾病有一定相關性，可能通過調節全身或局部的炎癥反應參與了根尖周牙槽骨的破壞。