強直性脊柱炎患者外周血IL-18系列的表達

付曉宇，劉建民

(錦州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧 錦州 121000)

強直性脊柱炎是一種病因尚不清楚的慢性風濕免疫性疾病，診斷時間長、當前可用療法的相對不足都迫切需要對疾病發病機理有更深入的了解。疾病早期表現為炎性腰背痛，休息后或夜間加重，活動后減輕。隨著疾病的發展，患者逐漸由出現骶髂至脊柱、髖關節的異位骨化，最終導致關節囊、脊柱周圍韌帶等等非骨質結構發生不可逆轉的異位骨化。疾病晚期特征性的脊柱“竹節樣變”和髖關節骨性強直融合是致畸、致殘的關鍵原因[1-2]，不僅限制患者身體活動范圍并帶來難以忍受的疼痛，還會影響患者的心理健康[3]。雖然具體機制尚不明確，但研究表明，AS的疾病發展主要包括炎癥和新骨形成兩個階段[4]，TNF-α對AS的炎癥發展起重要作用，目前腫瘤壞死因子拮抗劑是治療AS的主要藥物[5]。在對AS的早期抗炎治療中，雖能有效緩解強直性脊柱炎的早期癥狀[6]，但并沒有完全阻止晚期異位骨化的進展。反映AS的炎癥過程能促進異位骨化，但二者是兩個相互獨立的過程[7]。作為重要的細胞因子，IL-18與TNF-α在強直性脊柱炎患者血清中表達水平呈正相關[8]。IL-18是否參與了AS的發生發展，是通過炎癥反應促進異位骨化，還是直接參與異位骨化并不清楚。本實驗用檢測T細胞、中性粒細胞、B細胞、單核細胞中IL-18、IL-18R及IL-18BP的表達水平，探究IL-18、IL-18R及IL-18BP是否參與AS疾病發生，以及其主要的效應細胞，希望可以為延緩或抑制強直性脊柱炎骨化進展提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

嚴格按照1984年修訂的紐約標準及骶髂關節X線表現[9]，選擇2018年12月至2019年12月在錦州醫科大學附屬第一醫院就診的45例強直性脊柱炎患者，并排除其他風濕免疫性疾病等疾病。X線表現II級及以下為疾病早期組有24人，其中男性18例，女性6例，年齡18～57歲；III級及IV級為疾病晚期組有21人，其中男性16例，女性5例，年齡18～57歲。選擇同時期在該院進行體檢的45例健康人作為健康對照組(healthy control，HC)，其中男性30例，女性15例，年齡18～57歲。兩組受試者均知情同意本次研究。本研究已獲得倫理委員會批準實施，兩組性別、年齡構成比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 研究對象的一般資料

1.2 方法

1.2.1 收集血液樣本

抽取所有受試者3 mL空腹靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

1.2.2 采用全自動血沉分析儀檢測血漿ESR水平

采用免疫透射比濁法檢測血清CRP水平，全自動生化分析儀檢測血清ALP水平，采用酶聯免疫吸附法檢測血清中TNF-α、IL-18水平。

1.2.3 流式細胞術

離心棄上清后加入死細胞去除液和人Fc受體阻斷劑，室溫避光孵育15 min，依次加入抗CD4、CD8、CD16、CD19、CD14和抗IL-18R抗體，避光孵育15 min后裂解紅細胞離心，用固定/透明液固定細胞，依次加入抗IL-18抗體和抗IL-18BP抗體孵育30 min，透膜洗液清洗后加入BV510耦合驢抗兔Ig-G抗體，流式細胞儀檢測T細胞、中性粒細胞、B細胞、單核細胞的IL-18R、IL-18、IL-18BP的表達[10-11]。

1.3 統計學方法

所有數據均用GraphPad Prism 8.0進行統計學分析。組間比較采用t檢驗，Spearman秩相關進行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組外周血中CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平

AS組外周血中CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平較健康組高(P<0.05)，TNF-α、IL-18、ALP在疾病晚期組較疾病早期組高(P<0.05)，且TNF-α與IL-18兩者正相關(P=0.007，r=0.4887)，CRP、ESR在疾病早期組與疾病晚期組差異無統計學意義，見表2～4。

表2 AS組與健康對照組CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平比較

表3 疾病早期組與疾病晚期組CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平比較

表4 AS組CRP、ESR、TNF-α、ALP與IL-18的相關性分析

2.2 在強直性脊柱炎異位骨化患者外周血中表達IL-18的CD14+單核細胞比例升高

結果顯示，與健康對照組相比，在強直性脊柱炎異位骨化患者外周血中IL-18+單核細胞比例升高，IL18+的CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD16+中性粒細胞、CD19+B細胞的MFI升高，見圖1～2。

圖1 健康組與強直性脊柱炎組外周血IL-18+細胞的百分比

圖2 健康組與強直性脊柱炎組外周血各細胞IL-18 MFI的表達變化

2.3 在強直性脊柱炎異位骨化患者外周血中表達IL-18R的CD8+T細胞水平及CD8+T細胞IL-18R的MFI明顯升高

AS異位骨化患者組與健康對照組相比，表達IL-18R的CD8+T細胞比例及IL-18R+CD8+T細胞的MFI明顯升高，表達IL-18R的CD4+T細胞、CD14+單核細胞、CD16+中性粒細胞、CD19+B細胞的細胞比例及MFI差異無統計學意義，見圖3～4。

圖3 健康組與強直性脊柱炎組外周血IL-18R+細胞的百分比

圖4 健康組與強直性脊柱炎組外周血各細胞IL-18R MFI的表達變化

2.4 在強直性脊柱炎異位骨化患者外周血中IL-18BP+CD8+T細胞的MFI降低

結果顯示，較健康對照組，AS異位骨化患者外周血中IL-18BP+CD4+T細胞的細胞比例升高，MFI降低；IL-18BP+CD8+T細胞的細胞比例差異無統計學意義，MFI降低；CD14+單核細胞、CD16+中性粒細胞的細胞比例及MFI差異均無統計學意義；IL-18BP+CD19+B細胞比例下降，MFI升高，見圖5～6。

圖5 健康組與強直性脊柱炎組外周血IL-18BP+細胞的百分比

圖6 健康組與強直性脊柱炎組外周血各細胞IL-18BP MFI的表達變化

3 討 論

強直性脊柱炎是一種好發于青壯年的致畸致殘的慢性風濕免疫性疾病，存在炎癥和骨化兩個階段。炎癥在AS疾病早期開始出現，加重骨破壞，促進新骨形成[12]。但炎癥與新骨形成是兩個相互關聯又相互獨立的過程，目前抑制炎癥的主要藥物抗TNF-α并不能完全阻止骨化，說明AS可能不止通過TNF-α介導的炎癥來促進異位骨化。TNF-α、CRP、ESR作為重要的炎癥檢測指標，相關研究表明三者與AS的疾病嚴重程度和抗TNF-α治療后療效呈相關性，可以作為AS疾病嚴重程度輔助檢測指標[13-14]。本研究同樣也發現，CRP、ESR、TNF-α在AS組較健康對照組高，TNF-α在疾病晚期組較疾病早期組高。正常人體內通過成骨細胞與破骨細胞的穩態，維持著骨組織的正常生長。一旦這種穩態被打破，就會有異常的骨侵蝕或異位骨化[15]。新骨形成過程包含軟骨細胞被成骨細胞和破骨細胞取代、成纖維細胞向骨細胞轉化。主要由成骨細胞分泌的ALP，通過促進磷酸鈣在骨中沉積，影響骨組織生成[16]。本研究中，ALP在AS組較健康組高，在疾病晚期組較疾病早期組高，可能與AS的異位骨化相關，且在疾病晚期較疾病早期，異位骨化程度加重。

IL-18是一種多效性細胞因子，是IL-1家族成員，可由T細胞、NK細胞、樹突狀細胞、關節軟骨細胞、成骨細胞、滑膜成纖維細胞等多種細胞分泌，可同時參與調節先天和后天的免疫應答[17]。AS作為遺傳性疾病，HLA B27是已知的作為診斷AS的輔助檢測指標[18]。相關研究表明，AS的患者的滑液和外周血中有HLA B27限制性CD8+T細胞的表達[19]。而IL-18在抗原呈遞過程中對T細胞的活化具有多效性作用。IL-18最初確定為自然殺傷細胞和T細胞IFN-γ的有效誘導劑，與Th1反應有關。而IFN-γ會使髓樣細胞的分化從破骨細胞向樹突狀細胞轉移。IL-18通過誘導T細胞中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的表達來促進樹突狀細胞的分化而發揮類似的作用。IL-18還可以以宿主微環境依賴性方式調節Th2和Th17細胞反應及CD8+細胞毒性細胞與中性粒細胞的活性[20]。本次研究結果顯示，IL-18在AS組的表達水平比健康對照組高，在疾病晚期組中較疾病早期組高，且與炎性指標TNF-α呈正相關，提示IL-18可能通過影響TNF-α的水平參與AS的炎癥過程。

IL-18R作為IL-18的受體，IL-18與其結合發揮生物效應，IL-18R主要在T細胞、NK細胞、中性粒細胞中產生。Yu W等[21]的研究表明，IL-18R在成骨和AS發病中起著關鍵作用。IL-18BP作為IL-18的天然抑制蛋白，通過與IL-18結合，降低IL-18R表達的效應細胞的功能。在生物體中，IL-18的生物活性取決于IL-18產生的強度、IL-18BP的水平以及IL-18R的細胞表面表達水平，三者保持相對的穩態，維持機體正常[22]。

本次研究中，AS組外周血CD8+T細胞、CD14+單核細胞及CD16+中性粒細胞中IL-18表達增強，提示AS患者外周血IL-18水平升高可能與CD8+T細胞、單核細胞及中性粒細胞IL-18表達增高有關。AS組IL-18R+CD8+T細胞比例及MFI明顯升高，表明CD8+T細胞可能作為強直性脊柱炎異位骨化患者體內分泌的IL-18的主要效應細胞，發揮生物效應。提示CD8+T細胞、單核細胞、中性粒細胞分泌的IL-18參與AS炎癥的進展。外周血IL-18BP+CD8+T細胞在AS組中表達水平降低，提示在AS患者外周血中IL-18的生物活性增強可能與IL-18BP表達減少有關。

綜上所述，IL-18的過度表達與IL-18BP的表達降低，影響IL-18與IL-18BP的平衡，參與AS的炎癥階段，CD8+T細胞產生的IL-18、IL-18R、IL-18BP可能通過參與強直性脊柱炎的炎癥進展促進AS的異位骨化。研究CD8+T細胞產生的IL-18及IL-18BP可能會為治療TNFi療效不佳的患者提供新的治療方法。