尿促皮質素同源肽誘導乳大鼠心肌細胞肥大作用的比較

梁春光，黃雷，佟彤

(1.錦州醫科大學護理學院；2.錦州市藥品檢驗檢測中心，遼寧 錦州 121000)

促尿皮質素(UCN)是在1995年新發現的一個神經肽，與UCNⅡ和UCNⅢ是促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing factor，CRF)的家族成員，通過與CRF受體結合而發揮其生理作用。UCN能夠與CRF受體1和2結合，而UCNⅡ和UCNⅢ與CRF受體2具有更高的結合能力。研究發現，UCN對心臟具有保護作用，是一個很重要的心血管活性肽[1]。UCN對心臟具有正性肌力作用、缺血再灌心肌的保護作用及促進心肌肥厚作用。而且大量實驗也表明，UCN的心血管作用與細胞內Ca2+機制有關[2-3]，而且Ca2+信號在心肌肥厚和基因表達發揮著重要作用[4-5]。有研究發現，L-型Ca2+通道阻滯劑維拉帕米能夠抑制異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌肥厚[6]。本實驗室曾經多次報道了不同藥物對心肌細胞的肥大作用的作用機制[7-9]。而UCN同源肽誘導心肌細胞肥大與鈣離子之間的關系鮮有報道。

心肌肥厚是高血壓、心衰后心肌的一種代償性表現，是心臟病人猝死的一種重要的危險因素，所以心肌肥厚的相關研究受到了學者的重視。本研究將進一步探討尿皮質素同源肽誘導心肌肥厚可能的作用機制，通過比較尿皮質素同源肽誘導心肌細胞肥大，觀察尿皮質素同源肽誘導心肌肥大與心肌細胞[Ca2+]i的關系。

1 實驗材料與方法

1.1 藥品與試劑

UCN，UCNⅡ，UCNⅢ及異丙腎上腺素(ISO)均為美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、小牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶為杭州四季青生物工程材料有限公司；ANP一抗：Millipore公司；[3H]亮氨酸為上海原子核研究所產品；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

本實驗由錦州醫科大學實驗動物中心提供的出生2～4 d的SD大鼠的乳鼠完成，實驗動物雌雄不受限制。

1.3 心肌細胞培養

無菌環境下，將剛出生2～4 d的乳鼠心臟取出，然后放在Hanks液里面，反復沖洗3次，使用滅菌小剪刀迅速將心臟剪成小碎塊，再使用胰酶(0.8 g/L)在磁力攪拌下消化分散細胞，將分散后得的心肌細胞加入含84%DMEM培養基和15%小牛血清的培養基中，培養基含有100 mg/L鏈霉素和1×100 Ku/L青霉素雙抗。將細胞懸液經過反復吹打，吹打均勻后將細胞以1×109/L的接種密度接種于24孔培養板上，放入通以95%空氣及5%CO2的孵箱中進行細胞培養。

1.4 分組及給藥方法

心肌細胞常規培養2 d后，進行細胞換液，換液降低血清濃度是為了減少血清成分對實驗結果的影響，更換的液體為含0.04% 小牛血清的培養基，培養基中按照實驗分組加入各種濃度的試劑。實驗分成正常對照組、ISO組(10 μmol/L)、UCN組(0.1 μmol/L)、UCNⅡ組(0.1 μmol/L)、UCNⅢ組(0.1 μmol/L)。各項指標的測定時間為給藥后48 h。

1.5 培養心肌細胞體積的測量

通過測量細胞直徑獲得培養的心肌細胞體積。取出培養板，將長滿心肌細胞的培養孔用D-Hanks液快速沖洗3次，然后每個培養孔中加入0.3 mL胰酶(1 g/L)，將培養板再次放入37 ℃恒溫箱中消化30 min，取出培養板終止消化，方法是在每個培養孔中加入0.2 mL含有0.1體積分數血清的培養基；將消化下來的細胞完全收集，注入底部放置一個經硅化的蓋玻片的細胞室內，硅化的蓋玻片可以防止心肌細胞貼壁；于倒置顯微鏡下觀察細胞，顯微鏡放大400倍，心肌細胞均呈圓球形。測量單個細胞的直徑，按照文獻方法計算出單個細胞的體積，每組檢測的細胞數見文獻[9]65-68。

1.6 測定心肌細胞蛋白質的合成

將培養48 h 后已經成活的心肌細胞，更換培養基。培養基中含有37 TBq/L [3H]亮氨酸及不同濃度UCN等試劑。加藥后再培養48 h 。棄去培養液，冷Hank液沖洗細胞3 遍。使用1 mL SDS(10 g/L)溶解細胞，使用三氯醋酸(50 g/L)沉淀蛋白。應用GF/C過濾，烘干濾膜，放置在含有體積分數為4×10-3PPO的二甲苯溶液的閃爍杯中。用液閃儀測量[3H] 亮氨酸的結合，分析蛋白的合成。每個孔的細胞計數及實驗結果的表示見文獻[10]。

1.7 測定心肌細胞蛋白質的含量

棄掉培養板各孔中的培養液，用D-Hanks液快速沖洗3次后，加入0.5 mL SDS(10 g/L)溶解細胞。每孔細胞計數約為5×105個，使用Lowry方法測定每孔心肌細胞的蛋白含量。

1.8 Western蛋白印跡法測定心肌細胞ANP的表達

細胞加藥培養48 h后，取樣備用。取出樣品加入PMSF(10 g/L)，超聲裂解離心后取上清。應用BCA法測定蛋白濃度。上樣緩沖液并煮沸。10 μL樣品以及蛋白質標準物點樣。垂直電泳3～5 h，轉膜8～12 h；封閉，洗膜，稀釋后的兔抗大鼠ANP(1∶200)室溫反應2 h，二抗(1∶1500)反應1 h，顯影劑顯影。顯影條帶處理方式及實驗結果表示方式見文獻[9,11]65-68。

1.9 培養心肌細胞鈣離子瞬間變化([Ca2+]i)的測定

將生長有自發性搏動的心肌細胞的蓋玻片置于含有Fura-2/AM(3 μmol/L)的DMEM培養基中，在37 ℃水浴中避光孵育30 min后，取出蓋玻片，用HEPES緩沖液沖洗。將蓋玻片放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，用恒溫37 ℃灌流速度為1 mL/min 的HEPES緩沖液灌流，并按照指定時間于灌流液中加入實驗用藥。TiLL陽離子測定系統為測定儀器。激發光波長分別為340 nm及380 nm，300 ms為采樣間隙。計算心肌細胞[Ca2+]i的方法見文獻[12]。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 UCN同源肽對心肌細胞體積的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞體積分別增加了56.6%、32.9%、57.8%和31.4%，與ISO的肥大作用相比，UCNⅡ心肌細胞體積增加的程度更大，增加了57.8%。UCN及UCN Ⅲ組心肌細胞體積增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖1。

藥物同時分別加入不同組別培養液中培養細胞個細胞；與對照組比較，##P<0.01

2.2 UCN同源肽對心肌細胞蛋白質合成的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質合成分別增加了77.02%、39.8%、47.3%和38.4%。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質合成增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖2。

2.3 UCN同源肽對心肌細胞蛋白質含量的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質合成分別增加了56.2%、33.3%、17.6%和30.3%。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質含量增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖3。

與對照組比較，##P<0.01

與對照組比較，##P<0.01

2.4 UCN同源肽對心肌細胞ANP表達含量的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞ANP表達含量明顯增加了。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞ANP表達含量增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖4。

2.5 UCN同源肽對心肌細胞[Ca2+]i瞬間變化的影響

ISO及UCN同源肽均未明顯改變正常心肌細胞[Ca2+]i瞬間變化。ISO及UCN同源肽能夠增高心肌細胞內鈣離子瞬間變化的幅度，但是基線水平沒有變化，增快了心肌細胞自發頻率，對心肌細胞內靜息鈣的負荷均無影響，其中ISO的作用最強，見圖5。

A：ANP蛋白表達和β-actin 蛋白表達；B：ANP/β-actin 半定量結果；與對照組比較，#P<0.05

A：心肌細胞內代表性Ca2+變化曲線，UCN同源肽對靜息[Ca2+]i 水平；B：Ca2+ 變化幅度；C：Ca2+的定量分析；D：頻率，與正常對照組比較，#P<0.05

3 討 論

心肌肥厚作用是心臟的一種很重要的調整機制，是心臟負荷過重時一種代償表現，是心肌細胞對高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死等常見臨床疾病的一種基本反應。以上心臟疾病的初始階段，心臟通過平衡應激的增加改善心臟的功能使心肌肥厚，但是長時間的壓力會導致心肌持續性增厚，最終心臟功能會嚴重失衡從而發生心力衰竭，因此成為心血管病患者死亡的重要原因之一。因此研究心肌肥厚發生發展過程中的信號轉導機制和確定此作用中的調節因子非常重要。

許多研究已經表明，UCN同源肽是很重要的心血管活性肽。有研究說明UCN正性肌力作用的分子機制主要通過cAMP-PKA信號途徑介導[13]。許多研究表明，UCN具有心肌的保護作用，這種保護作用可以通過MAPK p42/44[2]568-571、PI3K-Akt[14]、PKCε[15]等信號途徑介導。許多研究已經表明，[Ca2+]i變化是心肌肥大的一個信號。多種鈣調節酶傳導不同的作用信號從而出現[Ca2+]i的改變，其中Ca2+/CaMK家族中的鈣調素依賴蛋白激酶就是最重要的一種酶，在此過程中發揮重要作用[4,9]1314-1321,65-68。PKC是一種依賴Ca2+、磷脂的蛋白激酶，可以與Ca2+相互調節而達到基因表達和細胞增殖等長期反應。

異丙腎上腺素是一個公認的誘導心肌細胞肥大的試劑，本實驗將UCN同源肽與異丙腎上腺素的致心肌細胞肥大作用進行比較，結果發現，在UCN同源肽中，UCNⅡ的致心肌細胞肥大作用最強，與文獻報道[16]結果一致。

綜上所述，UCN同源肽與異丙腎上腺素一樣能夠使心肌細胞內鈣離子穩態發生變化。UCN同源肽使心肌細胞內鈣離子瞬間變化幅度增高，但不影響基線水平，對心肌細胞內靜息鈣負荷均無影響，使心肌細胞自發頻率加快，說明UCN同源肽致心肌細胞肥大可能通過影響細胞內鈣離子穩態起作用。本實驗室曾報道UCN可以通過影響蛋白激酶A信號途徑，影響L-型鈣通道改變心肌細胞內鈣離子穩態起到致心肌細胞肥大作用[17]。但是對于UCNⅡ及UCNⅢ引起鈣離子改變是首次研究。細胞內鈣離子發生改變，可能由于細胞內鈣釋放還能是細胞外鈣離子內流，但是UCN同源肽引起心肌細胞內鈣離子改變的具體機制尚未明了，還需要具體研究。UCN同源肽致心肌細胞肥大的作用機制研究曾發現它們是通過不同的信號通路完成的，那么它們引起細胞內鈣離子改變是否通過不同的機制尚需要研究。