Rac 3通過MAGEA6/AMPKα途徑抑制肺腺癌A549細胞的自噬

杜天宇，肖旭陽

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000)

肺癌目前是我國最常見的惡性腫瘤，在中國每年肺癌新發病例73.33萬人，死亡病例61.02萬人，居惡性腫瘤發病率及死亡率的首位[1]。隨著人們體檢意識增強，肺腺癌的檢出率、發病率逐漸提升，因此肺腺癌的發生、發展、耐藥等基礎研究一直是腫瘤研究中的熱點。

Rac 3是一種分子量為21 kd的小分子蛋白，屬于Rac家族成員，該家族被認為是細胞骨架的重要調節因子，在神經發育及腫瘤中起到重要作用[2]。Rac 3在肺癌中表達增高，沉默Rac 3后影響肺腺癌A549細胞的侵襲、遷移、上皮間質轉化，抑制增殖并促進凋亡[3-5]。自噬是一種高度保守的生物學過程，在腫瘤生存條件惡劣時可以提供必要的養分供細胞生存，而另一方面自噬可誘導凋亡，進而導致腫瘤細胞的死亡。Rac 3能在多種細胞系內引起自噬[6]，但是探討Rac 3對肺癌自噬影響的研究較少，相關機制仍不明確。

CRISPR/cas9是一種新興的基因編輯技術，在小向導RNA(small guide RNA，sgRNA)的作用下可以切斷DNA雙鏈，并在基因組受損修復過程中發生移碼突變，從而達到敲除基因的效果[7]。本研究使用CRISPR/cas9技術，敲除肺腺癌A549細胞中的Rac 3基因并構建穩定表達的細胞系，并建立Rac 3過表達細胞株，探討Rac 3對肺腺癌自噬的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和主要試劑

1.1.1 細胞培養：肺腺癌細胞系A549購自中科院細胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI-1640，于37 ℃、5% CO2的恒溫恒濕培養箱內進行培養。

1.1.2 主要試劑：Addgene購買質粒pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459，Plasmid #48139)，Rac 3抗體夠自ABCam，SQSTM-1/p62、AMPKα購自萬類生物，LC3、Phospho-AMPKα、ERK 1/2、Phospho-ERK 1/2購自CST，AKT、Phospho-AKT、MAGEA6購自ProteinTech。

1.2 puro-cas9-Rac 3-sgRNA質粒的構建

1.2.1 sgRNA的設計與合成：通過在線工具(https://zlab.bio/guide-design-resources)設計2條sgRNA，分別位于第2、3外顯子，序列分別為：sgRNA1#：5’-CGGTGGGGATGTACTCTCCG-3’和sgRNA2#：5’-CGGGTCAGGAGGACTACGAT-3’。sgRNA的正義鏈及反義鏈由Takara公司合成，收到的2對寡核苷酸鏈常規退火。

1.2.2 sgRNA載體構建：PX459質粒使用BbsI酶37 ℃酶切1 h，T4連接酶16 ℃過夜連接，導入到感受態細胞DH5α凃板，挑菌提取質粒，BbsI酶切后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，選取不含酶切位點的質粒送堿基測序驗證。

1.3 Rac 3敲除及過表達A549細胞株的建立

1.3.1 敲除質粒轉染及單克隆提取：質粒使用Lipofectamine 3000試劑進行轉染，用篩選培養基(嘌呤霉素濃度1 μg/mL)篩選72 h后轉為維持濃度繼續培養，鏡下觀察單個細胞形成約含50個細胞的細胞集落時，消化稀釋細胞濃度至0.5個/微升，按2 微升/孔接種到96孔板內，標記出單個細胞的孔并加培養基繼續培養，約7 d后對標記的單克隆消化、擴大培養及鑒定。

1.3.2 Rac 3敲除細胞株的鑒定：根據sgRNA位置設計PCR引物，分別為：sgRNA1#(5’-CTTAGGTCGCCACGGATCTG-3’，5’-CTAGAACTCTGGCCAGCACC-3’)和sgRNA2#(5’-GGTGCTGGCCAGAGTTCTA-3’，5’-GGCTCACCAGAGAGAAGCAG-3’)。PCR產物使用T7EI酶于37 ℃反應20 min后進行瓊脂糖凝膠電泳，選取存在編輯的樣本送生物公司測序。

1.3.3 Rac 3過表達慢病毒感染A549細胞：Rac 3過表達慢病毒HBLV-h-RAC3-3xflag-NEO由上海漢恒公司包裝，A549細胞接種于96孔板，向孔內加入慢病毒，隨后用含G418培養基(800 μg/mL)進行篩選，72 h后降至維持濃度并擴大培養。

1.4 EBSS饑餓法誘導自噬

待檢測細胞按每個平皿按照1×106接種入10 cm培養皿中，至細胞融合約70%時棄液，PBS清洗2次后加入EBSS 10 mL，于37 ℃ 5%CO2的孵箱內，培育4 h后提取蛋白進行鑒定。

1.5 Western Blot檢測蛋白表達

待檢測的各細胞株在細胞融合至約70%時，用含PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液提取蛋白，并采用BCA法進行定量。各組進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉，4 ℃搖床過夜孵育一抗，二抗室溫孵育，ECL化學發光法進行顯影。

1.6 統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析，采用t檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 sgRNA的設計

從NCBI獲得人源Rac 3蛋白的cDNA，使用在線工具分別于第2、3外顯子上設計sgRNA1#和sgRNA2#，確保當基因編輯導致移碼突變時，所有的Rac 3轉錄本都不能正確翻譯，以達到敲除的效果，見圖1。

圖1 通過在線工具設計sgRNA序列

2.2 Rac 3敲除的驗證

將含有puro-cas9-sgRNA1#和puro-cas9-sgRNA2#的質粒轉染入A549細胞中，單克隆篩選后進行T7E1酶切實驗。由sgRNA1#、sgRNA2#介導的Rac 3敲除細胞株分別記為KO1、KO2。T7E1酶切實驗中KO1和KO2細胞株的PCR產物都被切成了大小不同的兩條帶，證實基因組DNA存在錯配，即兩種sgRNA都對基因組DNA進行了編輯。將發生基因編輯的KO1和KO2細胞株送測序，提示KO1存在2個堿基丟失，KO2存在35個堿基丟失，均達到移碼突變的效果，見圖2。

圖2 T7E1酶切實驗及Sanger測序驗證Rac 3基因編輯

2.3 Western Blot驗證Rac 3的敲除及過表達

對KO1、KO2兩珠Rac 3敲除細胞株及慢病毒過表達Rac 3細胞株(OE)提取蛋白進行Western Blot檢測，提示與野生型A549細胞(WT)相比，KO1、KO2細胞株的中Rac 3蛋白被完全敲除了，OE細胞株表達Rac 3-3xflag，且Rac 3表達水平明顯高于WT組，見圖3。

**P<0.01

2.4 EBSS誘導自噬后LC3、SQSTM-1/p62的表達

經過EBSS誘導自噬4 h后提取蛋白。與未誘導的WT組A549細胞相比，EBSS誘導后各細胞株的LC3 II及LC3 II/I的比值升高。EBSS誘導后，KO1和KO2兩組的LC3 II、LC3 II/I比值均高于WT組，SQSTM-1/p62低于WT組，OE組的LC3 II、LC3 II/I比值低于WT型，差異均具有統計學意義。提示在肺腺癌A549細胞中，Rac 3敲除后自噬被激活，Rac 3過表達自噬受到抑制，見圖4。

*P<0.05；**P<0.01

2.5 雙向調控Rac 3后相關蛋白表達的變化

EBSS誘導自噬后，對各組進行Western Blot檢測活化的caspase3、MAGEA6、AKT及其磷酸化蛋白、ERK 1/2及其磷酸化蛋白、AMPK及磷酸化蛋白的變化。在Rac 3敲除后，MAGEA6表達下降，AMPKα及磷酸化AMPKα的表達增強，caspase3活化增強；在Rac 3過表達后，MAGEA6表達升高，AMPKα及磷酸化AMPKα表達降低，caspase3活化減弱。Rac 3表達出現變化后AKT和ERK1/2變化不顯著。提示EBSS誘導自噬，Rac 3敲除可以促進凋亡，并且降低MAGEA6的表達，促進AMPKα的表達及磷酸化水平，進而促進細胞自噬，而Rac 3過表達則相反，見圖5。

*P<0.05；**P<0.01

3 討 論

本研究通過CRISPR/cas9技術敲除肺腺癌細胞系A549中的Rac 3基因，使用慢病毒感染的方法過表達了A549細胞中的Rac 3基因，再以EBSS誘導自噬的方法，確定了Rac 3抑制A549細胞的自噬，并初步明確了Rac 3是通過MAGEA6/AMPKα途徑影響肺腺癌自噬。簇狀規則間隔的短回文重復序列(CRISPR)是一種廣泛存在于微生物內的適應性免疫系統，在進行工程化后的CRISPR/cas9技術具有快速、低成本、高效、拓展性高等特點[7]。CRISPR/cas9技術是通過設計sgRNA引導cas9蛋白靶向切割基因組DNA達到DNA雙鏈斷裂，隨后細胞以非同源末端連接的方式修復基因組DNA，在這一過程中有概率發生堿基的插入或丟失并導致移碼突變，從而達到敲除基因的效果[8]。sgRNA序列通常為在線工具所設計，因存在與其他基因相似序列結合的可能，故CRISPR/cas9基因編輯存在脫靶的風險并導致實驗結論的錯誤[9]。本研究通過設計兩個位于不同外顯子的sgRNA，并設立過表達組來減少該類誤差。

Rac 3是小分子GTPase，這類蛋白常在細胞中起到分子開關的作用，目前已知其在腫瘤及神經發育中起到重要作用。既往的研究表明，在膀胱癌中Rac 3通過PYCR1/JAK/STAT通路促進增殖、遷移和侵襲性[10]，在肺癌中沉默Rac 3能抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡[4]3061-3065，并且Rac 3可以通過p38 MAPK途徑調節細胞遷移、侵襲和EMT[3]2511-2522，在乳腺癌中沉默Rac 3導致侵襲性減少[11]，Rac 3過表達誘導促生長和促遷移的基因，并且提示ERα陽性乳腺癌預后不良[12]。Rac 3在結腸癌中可以維持和誘導腫瘤細胞干性，并可以誘導非腫瘤細胞向腫瘤轉化[13]。Rac 3還可以增強宮頸癌細胞對順鉑的耐藥[14]。自噬是目前的一個研究熱點，在腫瘤細胞中自噬既可以保護腫瘤生存，同時也可以促進凋亡，而Rac 3被發現在多種細胞系中可以抑制自噬[6]35291-35298。我們研究發現在A549細胞中敲除Rac 3可以促進LC3 I型向II型轉化、p62積累水平降低及促進caspase3活化，而相反的過表達Rac 3抑制LC3 I型向II型轉化并抑制caspase3活化。這提示Rac 3對肺腺癌的自噬及凋亡起抑制的作用。在前期的預實驗中，我們對Rac 3敲除及過表達的細胞株做了RNA-Seq，篩選得到4個差異基因ADAMTS2、GABRA3、MAGEA6及CSRNP3，通過預實驗驗證及查詢文獻，我們推測Rac 3對自噬的抑制與MAGEA6基因有關。

MAGEA6是黑色素瘤抗原家族的成員，該家族成員在真核生物中保守，在腫瘤中常被異常激活。MAGEA6沉默在膠質瘤、腎細胞癌等多種腫瘤中直接上調AMPKα表達及磷酸化并抑制mTORC1通路[15-16]。MAGEA3/6可以特異性的結合TRIM28 E3泛素連接酶，導致AMPKα的泛素化降解[17]。在我們的研究中觀察到，當Rac 3敲除后MAGEA6表達隨之降低，這導致了AMPKα泛素化降解的減少，AMPKα及其磷酸化水平的增高。AMPKα磷酸化水平增高會抑制mTORC1的活性，從而解除了mTOR通路對自噬的抑制，導致自噬的增強[18-19]。當過表達Rac 3后，MAGEA6表達隨之升高，這導致AMPKα降解的增加及活性降低，從而導致mTOR通路被激活，抑制自噬。在肺癌等多種腫瘤中，Rac 3表達水平上升，這也就導致MAGEA6的高表達，進而抑制AMPKα并激活mTOR通路，導致自噬被抑制，從而達到減少凋亡、促進細胞成活的目的。但是Rac 3是如何調控MAGEA6的機制目前尚不確認，有待于進一步研究。

綜上所述，我們發現Rac 3可以上調MAGEA6的表達水平，抑制AMPKα表達及活性，激活mTOR信號通路，抑制自噬及凋亡，從而達到使肺腺癌細胞成活的目的。這提示Rac 3在肺腺癌中起到重要作用，可能會為肺癌的治療提供新的靶標。