顳葉外側(cè)癲癇患者腦組織NHE1及凋亡相關(guān)蛋白的表達

吳旭玲，董楝，彭爽，葉蘭，徐祖才，馮占輝

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563099

癲癇是大腦皮層神經(jīng)元異常放電所導(dǎo)致的以癇性發(fā)作為特點的臨床綜合征[1]。反復(fù)癇性發(fā)作導(dǎo)致大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡、壞死及丟失，然而機制尚不明確[2～4]。鈉氫交換體-1（Na+/H+exchanger-1，NHE1）屬于NHE家族成員[5]。Kang等[6]在癲癇易感性沙鼠癇性發(fā)作后取海馬進行研究，結(jié)果顯示海馬中NHE1蛋白在癲癇發(fā)作3 h明顯升高，6 h恢復(fù)正常，提示NHE1蛋白增高可能與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。本課題組前期研究證實顳葉外側(cè)癲癇患者腦組織m-calpain和μcalpain蛋白表達增高[7,8]，既往研究證實calpian蛋白表達增高與神經(jīng)元凋亡、壞死等病理變化密切相關(guān)[9]。calpain表達上調(diào)或者下調(diào)是通過鈣信號通路調(diào)控的。NHE1可以通過對鈣信號通路的調(diào)控直接或間接影響calpain蛋白表達，因此本組推測NHE1可能通過調(diào)控calpain的表達影響細胞凋亡及壞死的發(fā)生。目前尚未見NHE1在顳葉外側(cè)癲癇患者手術(shù)切除大腦標本中表達特點相關(guān)研究。本課題組收集顳葉外側(cè)癲癇患者手術(shù)切除大腦標本，探討NHE1在顳葉外側(cè)癲癇患者腦組織中的表達特點，并對腦組織進行凋亡的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會已審批本實驗，倫理批件號No.146。實驗嚴格遵守倫理委員會要求。選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科16例顳葉外側(cè)癲癇患者作為癲癇組，10例顳葉腫瘤和腦出血患者作為對照組。

癲癇組包括男10例，女6例；年齡11～48歲，平均（40.34±7.45）歲；簡單部分性發(fā)作患者2例，復(fù)雜部分性發(fā)作患者7例，部分性發(fā)作繼發(fā)全面性發(fā)作患者7例。入組條件[10]：①具有典型臨床表現(xiàn)，腦電圖提示單側(cè)顳區(qū)放電；②用3種及以上的臨床常用抗癲癇藥（左乙拉西坦、奧卡西平、丙戊酸、拉莫三嗪等藥物），癲癇門診治療2年及以上，但仍有發(fā)作，每月2次以上；③病人及其家屬知情同意且簽署相關(guān)協(xié)議書。排除標準：①顱內(nèi)與癲癇發(fā)作相關(guān)的感染性疾病可能；②合并有嚴重精神病病史；③家屬或者患者本人不同意。16例患者均接受單側(cè)部分顳葉手術(shù)切除，切除的顳葉組織作為實驗標本。

對照組中男7例，女3例；年齡14～55歲，平均（38.45±5.75）歲。標本來源于顳葉腫瘤或者顳葉腦出血手術(shù)患者，并以病灶周邊相對正常腦組織作為對照。該組所有患者符合下列條件：①腦組織HE染色基本正常；②病人及其家屬知情同意并簽署相關(guān)協(xié)議書。

兩組患者基線資料詳見表1～2。統(tǒng)計學(xué)分析顯示年齡無顯著差別（P>0.05）。

表1 16例顳葉外側(cè)癲癇患者臨床特點Tab.1 Clinical characteristics of 16 patients with lateral temporal lobe epilepsy

1.2 實驗方法

1.2.1 人腦組織處理 切除的腦組織分成小塊，部分腦組織塊用滅菌錫箔紙包裹于-80℃冰凍儲存，應(yīng)用于RT-PCR和Western blot檢測；部分腦組織用生理鹽水沖洗后以多聚甲醛固定，然后梯度葡萄糖脫水，液氮冷凍然后進行組織切片，切片厚度10μm，切片貼于聚賴氨酸包被的載玻片上，-80℃保存，用于免疫熒光檢測；部分腦組織采用石蠟包埋，包埋塊切片厚5 μm，用于免疫組化分析。

表2 10例對照組臨床特點Tab.2 Clinical characteristics of 10 cases in the control group

1.2.2 HE染色與免疫組化 石蠟切片在二甲苯中脫蠟，并于檸檬酸鈉緩沖液（10 mmol/L，pH 6）中以微波爐加熱10 min（98℃）進行抗原修復(fù)。在37℃恒溫浴箱內(nèi)，切片置0.3%H2O2中孵育10 min，然后用0.4%Triton X-100（Sigma）處理15 min，加入山羊血清針對非特異性抗原進行封閉（中杉金橋）。將切片與兔抗人NHE1的主要抗體（1：50；GeneTex）4℃孵育過夜。用PBS洗滌3次后，鼠抗兔二級抗體37℃孵育30 min，親和素-生物素復(fù)合液（中山金橋）37℃孵育30 min，PBS洗滌。用二氨基苯并胺（中杉金橋）檢測免疫反應(yīng)性，蘇木精復(fù)染。質(zhì)膜呈棕色染色的細胞被認為是NHE1表達陽性的細胞。作為陰性對照，用PBS代替原發(fā)性或繼發(fā)性抗體[10]。用PM 20自動顯微鏡（奧林巴斯，日本）采集圖像。

1.2.3 免疫熒光染色 取出冰凍切片，室溫晾干，然后用PBS緩沖液沖洗，5 min后將切片浸泡于枸櫞酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0），放于微波爐中選擇高火煮沸，5 min后再調(diào)至低火煮沸15 min，隨后取出在室溫下冷卻。0.4%Triton X-100（Sigma）37℃孵育，15 min后加入山羊血清（中杉金橋）37℃封閉非特異性抗原，甩掉多余血清，將配好的混合一抗滴入后4℃過夜。兔抗人NHE1（1：100，GeneTex），與Neun（神經(jīng)元標志物）的混合，小鼠抗人Neun抗體（1：50，Abcam）。次日，在37℃水浴箱復(fù)溫，1 h后沖洗一抗，滴加FITC標記的山羊抗兔二抗（1：100，中杉金橋）和TRITC標記的猴抗小鼠二抗（1：100，中杉金橋），將混合抗體在37℃避光孵育1 h，然后沖洗二抗，最后用50%甘油封片[8]。

1.2.4 蛋白印跡（Western blot）取出冰凍腦組織，磨碎腦組織，按試劑盒說明書提取腦組織中的蛋白（總蛋白提取試劑盒，凱基），用BCA試劑測定所提取的蛋白濃度（碧云天）。從樣品中提取50μg蛋白于8%SDS-PAGE上跑電泳，并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。室溫下用5%BSA孵育PVDF纖維膜1.5 h，然后用兔抗人一抗NHE1（1：4000，GeneTex），和β-actin（1：1000，Santa Cruz）孵育PVDF膜4℃過夜；次日，室溫下孵育NHE1膜，然后加入山羊抗兔二抗（1：5000，中杉金橋）中2 h。同樣方法應(yīng)用兔多克隆一抗Bcl-2（1：4000，GeneTex）和Bax（1：4000，GeneTex）。在暗室中加入ECL顯色試劑（Pierce公司）對蛋白條帶進行顯影。用Quantity One 4.6.2軟件分析NHE1的相對含量，βactin作為內(nèi)參[10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

收集數(shù)據(jù)，采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料表達采用均數(shù)±標準差（），如數(shù)據(jù)為正態(tài)分布資料，兩組間的比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，兩組間比較應(yīng)用秩和檢驗，以α＝0.05為檢驗水準，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

癲癇組腦組織有神經(jīng)元丟失，小膠質(zhì)細胞明顯增高，星型膠質(zhì)細胞增高（圖1B～D）；對照組顯示顳葉組織神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞未見明顯異常（圖1A）。

圖1 腦組織切片HE染色結(jié)果（標尺100μm）A：對照組左側(cè)顳葉腦組織神經(jīng)元形態(tài)基本正常 B：癇患者1，左側(cè)顳葉腦組織大量神經(jīng)元濃縮壞死（箭頭）C：癲癇患者2，小膠質(zhì)細胞增生以及小膠質(zhì)細胞進入壞死神經(jīng)元 D：癇患者3，箭頭示小膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)元丟失明顯Fig.1 The HE staining results of brain tissuesectionA:The morphology of neurons in the left temporal lobe was basically normal in the control group;B:Case 1,the left temporal lobe brain tissue,the black arrow indicated that a number of neurons were condensed and necrotic;C:Case 2,microglia proliferated and microglia entered into necrotic neurons;D:Case 3，the arrows indicated that microglia proliferated and neurons lost significantly.Scalebar 100μm

2.2 免疫組化和免疫熒光結(jié)果

癲癇組和對照組的神經(jīng)元細胞內(nèi)均可見棕黃色的陽性顆粒，集中于細胞膜和細胞漿，癲癇組平均OD值為（0.475±0.074），對照組平均OD值（0.215±0.052），二者比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），見圖2。免疫熒光結(jié)果顯示腦組織中NHE1（紅色信號）和Neun（綠色信號）共定位，見圖3。

圖2 免疫組化結(jié)果（標尺50μm）癲癇組（A）和對照組（B）神經(jīng)元細胞內(nèi)均可見棕黃色陽性顆粒，集中于細胞膜和細胞漿 C：計圖*P<0.05Fig.2 The results of immunohistochemistryThe neurons in the epileptic group(A)and the control group (B) had brownish yellow positive granules,which were mainly concentrated in the cell membrane and cytoplasm.C:Statistical diagram Scalebar 50μm

圖3 免疫熒光結(jié)果（標尺50μm）癲癇患者切除的腦組織中NHE1在神經(jīng)元表達明確，箭頭示神經(jīng)元中NeuN和NHE1共表達（NeuN為神經(jīng)元標志物）Fig.3 The results of immunofluorescenceThe expression of NHE1 in neurons wasclear(NeuN was the marker of neurons),and the white arrows showed the coexpression of NeuN and NHE1 in neurons,Scalebar 50μm

2.3 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果提示癲癇組NHE1蛋白表達較對照組NHE1蛋白表達增高（P<0.05）。癲癇組Bcl-2蛋白表達較對照組Bcl-2蛋白表達下降（P<0.05）；癲癇組Bax蛋白表達較對照組Bax蛋白表達增高（P<0.05），見圖4。

圖4 Western blot結(jié)果A：蛋白條帶B：NHE1蛋白定量C：Bcl-2蛋白定量D：Bax蛋白定量*P<0.05Fig.4 The results of Western blotA:Protein bands;B:Statistical diagram of the protein expression of NHE1；C:Statistical diagram of the protein expression of Bcl-2;D:Statistical diagram of the protein expression of Bax；*P<0.05

3 討論

NHE1是1989被克隆出來的蛋白，屬于NHE家族成員，表達在細胞膜上，在腦組織表達較廣泛[11]。NHE1作為細胞膜蛋白可以結(jié)合多種信號分子，結(jié)合后形成轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，可以對胞內(nèi)外信號做出快速而準確的反應(yīng)[12,13,14]。最主要功能是防止細胞酸中毒，維持酸堿平衡。

本研究HE染色可見癲癇患者顳葉腦組織神經(jīng)元丟失，小膠質(zhì)細胞增多，衛(wèi)星現(xiàn)象明顯，星型膠質(zhì)細胞增生。免疫組化結(jié)果提示癲癇組NHE1表達較對照組增高，Western blot結(jié)果提示NHE1蛋白表達增高，且凋亡相關(guān)蛋白Bax表達增高，Bcl-2表達下降。提示NHE1參與癲癇的發(fā)生或者發(fā)展，可能與凋亡密切相關(guān)。既往神經(jīng)病理學(xué)專家研究顯示癲癇非腫瘤性病變是導(dǎo)致癲癇常見的原因，包括海馬硬化、皮質(zhì)發(fā)育畸形、Sturge-Weber綜合征和Rasmussen腦炎等，且HE染色可見神經(jīng)元丟失，膠質(zhì)細胞增生，海馬硬化等等表現(xiàn)[4,15]。本研究與之一致。Li等學(xué)者[16]研究發(fā)現(xiàn)癲癇模型鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡及自噬明顯，且自噬發(fā)生在凋亡之后。本研究也發(fā)現(xiàn)在癲癇患者腦標本中凋亡現(xiàn)象明確。

本研究采用不同方法學(xué)手段，從組織學(xué)、分子生物學(xué)層面均證實NHE1表達在癲癇患者腦組織中表達是明顯增高的。NHE1結(jié)構(gòu)分為跨膜區(qū)域和細胞內(nèi)調(diào)節(jié)區(qū)域。其功能為將胞內(nèi)的H+和胞外的Na+進行進行1：1交換，調(diào)控細胞內(nèi)的酸堿度[17]。NHE1表達增高，調(diào)控細胞酸堿平衡的功能增強。該結(jié)果提示NHE1表達增高可能改善神經(jīng)元在癇性放電后所致的酸中毒，把H+排出去，把Na+交換進來。當(dāng)過度的Na+進入神經(jīng)細胞后，細胞內(nèi)Na+超載也會刺激Na+/Ca2+交換體（NCX）活性增強，從而增加細胞內(nèi)Ca2+濃度[13]。結(jié)合本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元凋亡、壞死等病理變化密切相關(guān)的m-calpain和μ-calpain蛋白表達增高[7,8]。神經(jīng)元內(nèi)Ca2+離子濃度變動較大時，可以激活m-calpain和μ-calpain蛋白，進而促發(fā)水解酶對細胞骨架和相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解作用，從而破壞結(jié)構(gòu)蛋白以及酶的功能，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或壞死。

綜合上述分析，本課題組認為NHE1可能機制如下：由于神經(jīng)元反復(fù)放電后缺血缺氧，神經(jīng)元內(nèi)呈現(xiàn)酸化狀態(tài)，NHE1被激活，NCX活性增強，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度超載。Ca2+進一步激活mμ-calpain最終導(dǎo)致Bax蛋白表達增高，以及Bcl-2蛋白表達下降，凋亡發(fā)生。

本研究有不足之處。該研究是基于臨床標本推測發(fā)病機制，無法開展機制相關(guān)研究，也無法進行相關(guān)干預(yù)研究。在進一步的動物及細胞學(xué)實驗中將深入探討發(fā)病機制。

總之，NHE1表達增高可能是癲癇發(fā)生和發(fā)展的促發(fā)因素，在癲癇反復(fù)發(fā)作過程中，為維持酸堿平衡，過度激活導(dǎo)致鈣離子激活，促進凋亡發(fā)生可能性較大。本研究為進一步深入探討癲癇機制提供了研究基礎(chǔ)，同時有助于NHE1相關(guān)藥物的研發(fā)。