硫化氫對氧糖剝奪/復氧神經元細胞自噬和凋亡的作用研究

蔣文武，洪岳，鄔力祥，鄧呂紅

1.南方醫科大學第五附屬醫院神經外科，廣州 510920；2.中南大學基礎醫學院生理學系，長沙 410013；3.南華大學附屬第一醫院神經外科，湖南 衡陽 421001；4.南方醫科大學第五附屬醫院眼科，廣州 510920

腦卒中是全球成人死亡和永久性致殘的主要原因，60%～80%的腦卒中患者是由于急性血管阻塞所致，由于缺血缺氧導致神經元不可逆損傷，伴隨患者神經系統功能損傷，甚至死亡。其中缺血再灌注損傷對腦卒中的作用引起了學者的長期關注[1]。研究顯示自噬在腦缺血再灌注損傷中具有多重作用[2]。自噬是一種高度保守的生物現象，參與炎癥、腫瘤和神經系統疾病等多種疾病[3]。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化碳和一氧化氮之后被發現的第3種氣體信號分子，機體內有完備的內源性H2S生成機制。H2S參與調節線粒體功能、細胞氧化還原狀態，發揮多種保護作用。H2S生成障礙可引起多種疾病，例如肝損傷、腎損傷以及神經系統疾病[4,5]。本組既往研究證明外源性H2S可以減輕大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）引起的腦缺血再灌注損傷，并在離體實驗中初步觀察到外源性H2S可以減輕氧糖剝奪-復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）引起的神經元細胞的凋亡[6]，但其具體機制尚未闡述清楚。磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內高度保守的能量狀態的感受器，是參與維持細胞能量代謝穩態的一種重要的信號分子[7]。研究報道AMPK可以通過mTOR調控細胞的自噬過程[8]。AMPK對mTOR活性的抑制參與低氧誘導的細胞自噬的激活[9]，可能在缺血再灌注誘導的組織損傷中扮演著重要的角色[7,10]。本研究進一步探討外源性H2S是否通過AMPK/mTOR通路抑制自噬從而減輕OGD/R誘導的神經元細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 AMPK過表達質粒（上海吉凱基因）、Opti-MEM（Gibco，美國）、Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）、RPMI-1640培養基（Gibco，美國）、胎牛血清（Gibco，美國）、TRIzol（Invitrogen，美國）、逆轉錄試劑盒（Fermentas，美國）、Taq PCR Mix（The rmo，美國）、PVDF膜（Millipore，美國）、p-AMPK一抗（武漢三鷹）、AMPK一抗（武漢三鷹）、p-mTOR一抗（CST，美國）、mTOR一抗（CST，美國）、p62一抗（CST，美國）、cleaved caspase 3一抗（Abcam，美國）、β-actin一抗（Abcam，美國）、ECL發光試劑（Millipore，美國）、caspase3活性檢測試劑盒（Promega，美國）。

1.1.2 主要儀器 Real time-PCR儀（Bio-Rad，美國）、全自動多功能酶標儀（The rmo Scientific，USA）、倒置顯微鏡（Nikon，日本）、CO2恒溫細胞培養箱（IT61，日本）、凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 神經元細胞PC12培養 大鼠神經元細胞PC12細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養。細胞培養于含5%CO2的37℃培養箱中。

1.2.2 細胞分組處理 探討H2S對OGD/R誘導的大鼠神經元損傷機制時，分為正常組、OGD/R組和（OGD/R+NaHS）組，其中（OGD/R+NaHS）組在操作中增加NaHS（100μmol/L）。探討AMPK在H2S減輕OGD/R誘導的大鼠神經元損傷時，分為轉染對照質粒組、轉染AMPK過表達質粒組，（轉染對照質粒+OGD/R）組，以及（轉染AMPK過表達質粒組+OGD/R）組。

1.2.3 OGD/R模型建立 根據文獻報道[11]，PC12細胞更換為無糖D-Hank’s液后，置于密閉盒子內，快速充入95%N2和5%CO2的混合氣體，重復3次后置于37℃恒溫箱中進行氧糖剝奪4 h；隨后將細胞培養基更換成含血清的RPMI-1640培養基，置于常規含5%CO2的37℃培養箱中繼續培養，24 h后收集細胞進行后續檢測。

1.2.4 AMPK過表達質粒轉染 PC12細胞接種于12孔培養板，采用不含雙抗的培養基培養，待細胞融合至50%左右，取0.8 g質粒與50 L Opti-MEM混合，室溫下溫育5 min。將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取1 L Lipofectamine 2000試劑在另一管中與50 L Opti-MEM混合，室溫下溫育5 min。把稀釋后的質粒與稀釋后的Lipofectamine2000進行混合，輕輕地顛倒混勻。室溫放置20 min后加入培養細胞。4 h后，更換新鮮含血清的培養基繼續培養72 h。轉染后細胞可進行后續實驗。

1.2.5 real-time PCR檢測基因表達 PC12細胞處理后，采用TRIzol裂解，并按照說明書提取細胞總RNA，取1μg總RNA逆轉錄為cDNA，并以此為模板采用real-time PCR法檢測目的基因的表達。根據各基因的Ct值，采用2-Ct法計算各基因的相對表達量。本研究所用大鼠特異性引物序列如下：AMPK：正向TTCGGGAAAGTGAAGGTGGG，反 向GGTTCTGGA TCTCTCTGCGG；Caspase 3：正 向GGAGCTTGGAA CGCGAAGAA，反向ACACAAGCCCATTTCAGGGT；β-actin：正 向GTCGTACCACTGGCATTGTG，反 向CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 PC12細胞處理后，采用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液收集總蛋白，經濃度測定后取30μg總蛋白在12%SDS-PAGE膠上電泳分離，之后轉移至PVDF膜上，經5%小牛血清封閉后分別孵育一抗（p-AMPK：1：2000；AMPK：1：1000；p-TOR：1：1500；TOR：1：2000；p62：1：1000；cleaved caspase 3：1：1000；β-actin：1：1000），4℃過夜；次日洗去未結合一抗后室溫孵育相應的HRP-二抗（1：7500）；最后采用ECL化學發光試劑顯色，各目的條帶的灰度值與內參β-actin灰度值的比值表示其相對表達量。

1.2.7 細胞Caspase-3活性檢測 PC12細胞經不同處理后，收集細胞并充分裂解，隨后嚴格按著試劑盒說明書操作，最后使用多功能酶標儀檢測細胞內Caspase-3活性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計處理，計量資料采用均數±標準差（）表示。兩獨立樣本均數比較采用t檢驗，多組樣本均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用S-N-K檢測。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NaHS對OGD/R處理神經元細胞mTOR蛋白表達的影響

OGD/R處理明顯降低大鼠神經元PC12細胞pmTOR蛋白的表達（P<0.05，圖1A～B），而總mTOR蛋白表達未見明顯改變（P>0.05，圖1C）。而NaHS處理能顯著提高OGD/R誘導神經元細胞中p-mTOR蛋白表達（P<0.05，圖1D），增加p-mTOR/mTOR的比值（P<0.05，圖1）。且NaHS處理能顯著降低OGD/R誘導神經元細胞LC3-II與LC3-I比值（P<0.05，圖1），提示外源性H2S可激活OGD/R神經元細胞mTOR信號通路，從而抑制OGD/R誘導的自噬。

圖1 NaHS對OGD/R大鼠神經元細胞mTOR蛋白表達的影響（n=6）A、E：Western blot條帶B：p-mTOR蛋白含量分析圖C：mTOR蛋白含量分析圖D：p-mTOR與mTOR比值F：LC3-II與LC3-I比值*P<0.05，與Control組相比#P<0.05，與OGD/R組相比Fig.1 The effect of NaHSon the expression of mTORprotein in neurons of OGD/RratsA，E:The image of Western blot；B：Diagram of p-mTOR protein content；C：Diagram of mTOR protein content；D：The ratio of pmTOR and mTOR;F：The ratio of LC3-IIand LC3-I;*P<0.05,vs control group;#P<0.05,vs OGD/Rgroup

2.2 NaHS對OGD/R處理神經元細胞AMPK蛋白表達的影響

Western blot結果顯示OGD/R處理大鼠神經元PC12細胞24 h可顯著增加胞內p-AMPK蛋白表達（P<0.05），總AMPK蛋白表達未見明顯改變（P>0.05）。而NaHS處理可明顯降低OGD/R大鼠神經元細胞p-AMPK蛋白的表達（P<0.05），并降低p-AMPK/AMPK的比值（P<0.05，圖2）。表明外源性H2S抑制OGD/R神經元細胞AMPK磷酸化。

圖2 NaHS對OGD/R大鼠神經元細胞的AMPK蛋白表達的影響（n=6）A：Western blot條帶B：p-AMPK蛋白含量分析圖C：AMPK蛋白含量分析圖；D：p-AMPK與AMPK比值*P<0.05，與Control組相比#P<0.05，與OGD/R組相比Fig.2 The effect of NaHSon the expression of AMPK protein in neurons of OGD/RratsA:The image of Western blot；B：Diagram of p-AMPK protein content；C:Diagram of AMPK protein content；D：The ratio of p-AMPK and AMPK;*P<0.05,vs control group;#P<0.05,vs OGD/Rgroup

2.3 AMPK過表達對NaHS調節OGD/R神經元mTOR蛋白和p62蛋白表達的影響

為闡明AMPK在NaHS減輕OGD/R誘導神經元細胞自噬中的作用，采用AMPK過表達質粒轉染細胞。結果顯示AMPK過表達質粒顯著增加PC12細胞AMPK mRNA和蛋白表達（P<0.01，圖3A～C）。與Control組相比，AMPK過表達預處理的大鼠神經元OGD/R處理24 h后p-mTOR蛋白表達顯著降低（P<0.05），而p62蛋白的表達增加（P<0.05，圖3D～F）。提示外源性H2S通過抑制AMPK、激活mTOR磷酸化，從而降低大鼠神經元細胞自噬。

圖3 AMPK過表達對NaHS調節OGD/R神經元細胞的mTOR蛋白和p62蛋白表達的影響（n=3）A：AMPK mRNA表達B～C：AMPK蛋白表達D：Western blot條帶E：p-mTOR蛋白含量分析圖F：p62蛋白含量分析圖G：Western blot條帶H：LC3-II與LC3-I比值*P<0.05，與control質粒組相比**P<0.01，與control質粒組相比Fig.3 The effect of AMPK over expression on the expression of p-mTOR and p62 in neurons of OGD/Rrats(n=3)A:The expression of AMPK mRNA；B～C：The expression of AMPK protein；D:The image of Western blot；E:Diagram of p-mTORprotein content；F：Diagram of p62 protein content；G:The image of Western blot；H：The ratio of LC3-IIand LC3-I;*P<0.05,vs control plasmid group;**P<0.01,vs control plasmid group

2.4 AMPK過表達對NaHS處理OGD/R神經元細胞凋亡的影響

與Control組相比，AMPK過表達質粒預處理的大鼠神經元OGD/R后，凋亡相關蛋白Caspase-3 mRNA顯著上調（P<0.05），Caspase-3的活化形式cleaved Caspase-3蛋白表達以及Caspase-3活性顯著升高（P<0.05）。此外，DNA片斷含量明顯升高（P<0.05，圖4）。表明過表達AMPK可消除NaHS減輕OGD/R誘導的神經元細胞凋亡。

圖4 AMPK過表達對NaHS減輕OGD/R誘導PC12細胞凋亡的影響（n=5）A：Caspase-3 mRNA表達B～C：cleaved-Capase-3蛋白表達D：Caspase-3活性檢測結果E：DNA片段化結果*P<0.05，與control組相比**P<0.01，與control組相比Fig.4 The effect of AMPK over expression on the apoptosis of PC12 cellsreduced by NaHS(n=5)A:The expression of caspase-3 mRNA；B～C：The expression of caspase-3 protein；D：Result of the activity of caspase-3;E:Result of DNA fragment；*P<0.05,vs control group;**P<0.01,vs control group

3 討論

腦組織缺血時神經元細胞經歷氧糖剝奪，在血流恢復時神經元的氧糖供應也隨之得以恢復，但在這個過程中，神經元發生了復雜的分子生物學改變。本研究在前期工作基礎上，觀察到大鼠神經元經歷OGD/R后，胞內AMPK激活，從而抑制mTOR，最終導致自噬活性異常增強，誘導細胞損傷。而外源性H2S預處理，可減輕上述過程，體現出細胞保護效應。因此，本研究從細胞水平上闡述了H2S減輕OGD/R誘導的神經元損傷，豐富了H2S減輕腦卒中的分子機制。

AMPK是一個可表達在全身各器官細胞內，高度保守的能感應能量狀態的感受器。當機體發生饑餓和缺氧等時，胞內AMP/ATP比例升高，AMPK則被激活，繼而磷酸化下游蛋白以維持穩態。本研究觀察到發生腦缺血再灌注時，神經元處于低氧和能量供給不足的狀態，AMPK磷酸化水平增高，提示AMPK激活。研究報道心肌細胞發生OGD/R時，AMPK活性也發生改變[12]。但與本研究不同的是，采用激動劑激活AMPK可減輕OGD/R誘導的心肌細胞損傷[12]，這可能與AMPK激活后下游分子事件存在差異有關。近期有研究報道，阻斷H2S的內源性生成，可異常激活AMPK，導致OGD/R誘導的神經元發生內質網應激，加重細胞損傷[13]，這進一步證實H2S能夠抑制OGD/R時神經元AMPK的異常激活，從而減輕細胞損傷。

自噬在神經元中的作用存在雙刃劍的效應。一定程度的自噬具有自我保護作用，例如自噬可清除受損傷的線粒體，維持胞內穩態[14]。然而，過度激活的自噬也參與大腦缺血再灌注損傷。Feng等[15,16]報道柚皮苷通過抑制線粒體自噬而減輕大腦缺血再灌注損傷。此外，右旋美托咪啶通過上調HIF-1α，抑制神經元自噬，從而減輕小鼠腦缺血再灌注損傷[17]。本組前期研究中觀察到MCAO誘導的大鼠腦缺血再灌注損傷時，腦組織自噬活性異常增強[6]，而在OGD/R處理的大鼠神經元中mTOR活性下降，提示異常增強的自噬可能是導致神經元損傷的重要機制。本研究也豐富了自噬在神經元缺血再灌注損傷中的作用。

腦組織缺血時神經細胞發生以凋亡為主的神經元死亡，文獻顯示減輕神經細胞凋亡可以有效降低腦梗死體積[18]。本研究觀察到過表達AMPK可消除NaHS減輕OGD/R誘導的神經元細胞凋亡，提示NaHS可能通過激活AMPK減輕OGD/R誘導的神經元細胞凋亡。

H2S在神經系統中的內源性保護作用日益突顯。例如，內源性H2S生成障礙可加劇帕金森病小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的神經元的損傷[4]。H2S可以通過降低氧化應激，抑制自噬性的神經元細胞死亡，從而減輕脊髓缺血再灌注損傷[19]。本組前期研究已證實外源性補充H2S可減輕MCAO誘導的大鼠腦缺血再灌注損傷[6]。因此，繼續探討H2S在多種神經系統疾病的代謝改變機制，明確內外源性H2S的保護作用和機制，可盡早實現H2S的臨床運用。

綜上所述，本實驗從細胞水平證實了H2S可通過抑制AMPK活化，進而抑制缺血再灌注時大腦神經元過度的自噬，最終減輕神經元損傷。本實驗揭示了H2S減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的分子機制，為H2S的臨床運用提供了可靠的實驗依據。