核纖層蛋白Lamin A/C負性調控ASCs增殖促進應力誘導脂肪再生的實驗研究

任婧，萬玲玲，2，魯峰，陳曦航

1.南方醫科大學南方醫院整形美容外科，廣州 510515；2.宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000

如何重建因創傷、腫瘤切除、先天性缺陷等導致的軟組織缺損是整形外科領域所面臨的巨大挑戰[1]。傳統的組織工程技術以外源性種子細胞、支架材料和微環境為基礎所構建出的脂肪組織，由于存在外源性感染風險、體積小及長期轉歸不理想等因素，仍然達不到臨床所需大體積脂肪組織的構建標準，這極大限制了其應用范圍。

“組織工程室技術”利用在體脂肪組織本身豐富的脂肪來源間充質干細胞（adipose-derived stromal cells，ASCs）、細胞外基質支架及微環境所構建的工程室化脂肪組織，為大體軟組織缺損修復提供了新的解決方案[2,3]。課題組前期通過微創手術游離小體積帶蒂脂肪瓣，結合外負壓吸引裝置（external volume expansion,EVE），成功地構建了預擴張工程化脂肪瓣（expanded prefabricated adipose tissue，EPAT），實現了全內源性大體積脂肪再生[4]。這在大體積工程化脂肪組織的構建中展現出了良好的應用前景。然而應力參與構建工程化脂肪組織的分子機制尚不明確。

ASCs作為參與脂肪再生的關鍵種子細胞，可以直接分化為脂肪細胞，并在宏觀上體現為脂肪組織體積的增大[5]，探索其增殖機制是明確應力誘導脂肪再生的關鍵環節。我們前期發現力學刺激作用于細胞外基質（extracellular matrix,ECM），而ASCs可通過其細胞膜表面特異性力學感受器Integrinβ1感應并轉導力學信號并傳導至細胞質骨架（fibrous actin,Factin），繼而產生增殖效應[4]。然而這僅是我們對ASCs內力學轉導信號的初步探索，其下游機制值得進一步深入研究。

近年來，細胞核不僅作為細胞內硬度最高和基因轉錄發生的亞細胞結構，而且作為新型力學感受器，成為細胞生物力學領域的研究熱點之一[6]。其中，位于細胞核內膜與染色質之間的核纖層蛋白（Lamins），是胞核骨架的重要組成部分[6]。Lamins通過LINC復合體（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton complex）與細胞質骨架直接結合，同時可直接與染色質上DNA片段結合，這為細胞內力學信號的傳導提供了良好路徑[7]。Lamins分為A型和B型，A型主要包括異構體Lamin A和Lamin C，B型主要包括Lamin B1和Lamin B2[8]。研究表明，Lamins在細胞力學信號傳導中發揮著重要作用，其異常表達或突變可減弱細胞對機械刺激的敏感性及反應性[9]。因此，本課題將探索核纖層蛋白Lamins對ASCs機械敏感性及增殖的調控作用，探討外負壓吸引促進脂肪瓣再生的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10周清潔級SD雄性大鼠42只，平均體重為（370±20）g，購買后飼養于南方醫科學大學實驗中心。每日常規飲食。

1.1.2 主要試劑及儀器 多聚甲醛、I型膠原酶等購自Sigma公司；Lamin A/C、Lamin B1、Lamin B2抗體購自美國abcam 公司；Western blot試劑盒購自德國Rebstock公司；Integrinβ1敲低慢病毒的制備、Lamin A/C過表達慢病毒的制備這部分實驗委托中國上海吉凱基因化學技術有限公司完成；大鼠ASCs專用培養基購買自中國賽業生物科技有限公司；Flexcell細胞培養板購買自美國Flexcellint國際公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPAT構建 將3%戊巴比妥按30 mg/kg注射入大鼠腹腔，靜待其深入麻醉后，將大鼠腹部剃毛并固定于小動物固定臺。術前于大鼠下腹部用醫用碘伏及酒精消毒3遍，隨后鋪單并暴露手術區域。

行腹股溝轉瓣手術：用11號尖刀于一側腹股溝區域做長約1.5 cm，平行于髂前上棘的斜行切口。沿腹股溝脂肪瓣分離脂肪組織，暴露軸型血管并給予仔細保護，隨后于腹股溝背處結扎血管遠端并離斷脂肪瓣，修剪脂肪瓣使其大小約2.5 cm×1 cm。于大鼠下腹部分離皮下隧道，隨后將帶蒂脂肪瓣轉移至下腹部中線處,并用5-0可吸收線將脂肪瓣遠端固定于腹部筋膜上。生理鹽水沖洗檢查有無出血點，用6-0尼龍線間斷縫合皮膚，術畢。此步驟是為了將大鼠的腹股溝脂肪瓣轉移至腹部中線處，方便隨后的負壓外擴張器的使用。

放置組織外擴張負壓裝置（EVE）：術后1星期可見大鼠腹股溝傷口愈合良好，便開始給予負壓吸引。將大鼠固定于體外定制的小動物固定器內，標記脂肪瓣在皮膚表面的投影，隨后將負壓吸引裝置固定于大鼠腹部，調節參數，負壓罩直徑為2 cm，負壓值為-2 kPa，每次持續負壓吸引6～8 h。對照組同樣固定于體外定制的小動物固定器內6～8 h，不給于負壓吸引處理(圖1)。

圖1 預擴張脂肪組織（EPAT）大鼠動物模型示意圖Fig.1 The animal model of expanded prefabricated adipose tissue（EPAT）

1.2.2 SD大鼠ASCs培養與分組 在超凈臺內用將SD大鼠腹股溝脂肪瓣剪碎，用0.2%的I型膠原酶恒溫搖床中37℃消化60 min，終止消化，1000 r/min離心5 min取細胞沉淀，用生長培養基重懸后接種于培養皿中培養，48 h后第1次換液，以后隔2d換1次液體，細胞生長融合達90%時按1：2比例傳代。

通過慢病毒構建Integrinβ1 ASCs表達抑制模型；運用3D打印技術構建體外靜態細胞拉伸裝置，同時給予對照組組和Lamin A/C過表達組12%、6%、0%的靜態形變作用，通過細胞免疫熒光、Western Blot檢測Lamin A/C表達情況。

通過慢病毒構建Lamin A/CASCs過表達模型；運用3D打印技術構建體外靜態細胞拉伸裝置，同時給予對照組組和Lamin A/C過表達組12%、6%、0%的靜態形變作用，通過細胞免疫熒光、Western Blot檢測ASCs增殖情況。

1.2.3 細胞加力裝置及細胞加力 我們使用3D打印定制的靜態細胞拉伸裝置（Flexcell Device）[4]對細胞進行拉伸作用。Flexcell Device由聚四氟乙烯材料構建的底座，和帶有彈性膜的Flexcell Bioflex平板（標準6孔板）構成的上板組成。通過設置底座上聚四氟乙烯圓柱的高度即可調節施加在彈性膜上的形變水平。我們采用了12%、6%和0%的形變參數，分別由高14.36 mm、12.07 mm和6.8 mm的圓柱產生。當底板與Bioflex彈性六孔板疊加合并時，圓柱將作用于Bioflex彈性六孔板的彈性膜，并將彈性膜向上部頂起，制造出膜中心與膜外周的高度差，繼而使彈性膜產生穩定的形變，與此同時種植于彈性膜表面的細胞也將通過粘附作用產生相應的形變（圖2）。

圖2 靜態拉伸系統裝置示意圖Fig.2 Illustration of Flexcell devicein vitro

1.2.4 免疫印跡檢測 提取組織/細胞裂解物。Bradford法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與Loading buffer混合，100℃水浴中加熱5 min，離心后取上清，配制12%分離膠、5%濃縮膠，SDS-PAGE電泳,隨后將蛋白轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加一抗：Lamin A/C、Lamin B1、Lamin B2和內參GAPDH，4℃孵育過夜，TBS洗膜后分別加二抗，37℃孵育1 h，洗膜后進行ECL化學發光、曝光、顯影，以Lamin A/C、Lamin B1、Lamin B2與GAPDH灰度值之比作為蛋白的相對表達量。

1.2.5 組織染色切片 4%多聚甲醛固定脂肪瓣；行脫水、石蠟包 埋等處理；行組織石蠟切片Lamin A/C免疫化學染色，并在光學顯微鏡下拍照，最后通過圖像分析評估Lamin A/C表達情況。

1.2.6 細胞免疫熒光檢測 4%多聚甲醛固定細胞15 min；洗滌后0.3%TritonX-100通透10 min，洗滌后山羊血清封閉液封閉60 min；加入一抗4孵育過夜。次日洗滌后加入熒光染料標記的二抗避光孵育90 min；洗滌后DAPI核染色劑避光孵育10 min，洗滌后加入防熒光淬滅劑。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統計分析

數據呈現平均值與正負誤差值，使用Graph Pad Prism Software version 6.0軟件對數據進行統計分析。每次測試3次獨立的實驗結果進行統計。統計分析方法使用獨立樣本t檢驗，單因素方差分析或雙因素方差分析進行檢測，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 EVE作用早期EPAT內ASCs增殖顯著增多

EVE作用下，可見Ki67陽性的細胞（圖3）散在分布于脂肪組織的間質中，并且脂肪瓣中細胞Ki67陽性的細胞的數目于第1周明顯增多，后隨時間逐漸減少,但在對照組中，于脂肪間質中只發現了零星散在的Ki67陽性的細胞，并于各時間點未見明顯數量級變化。統計結果（圖3）提示,在不同時間點,實驗組Ki67陽性的細胞的數目明顯高于對照組（P<0.05）。并且在實驗組中Ki67陽性的細胞的數目在第1周達到峰值，但從第4周第8周逐漸下降（P<0.01）。反之對照組中細胞Ki67陽性的細胞的數目隨時間沒有顯著變化，未有統計學差異。

圖3 脂肪瓣中細胞增殖情況檢測Ki67的免疫組化染色圖及Ki67陽性細胞數的統計分析圖（#和##代表不同時間點實驗組與對照組比較，P<0.05，P<0.01；**表示不同時間點實驗組組間比較，P<0.01）；標尺=100 mm）Fig.3 The changes of cell proliferation during adipose tissue regeneration at different time pointsImmunohistochemical staining of Ki67 and quantification analysis of Ki67-positive cells in both groups at indicated times(#,##indicated P<0.05 and P<0.01 experimental group compared with control group at different times,respectively;**indicated P<0.01,comparison of experimental group at different times;Scalebars=100 mm)

2.2 EVE作用早期EPAT內Lamin A/C的表達量顯著下降

我們首先檢測了Lamin B1、Lamin B2、Lamin A/C的表達情況，結果顯示（圖4 A），與未施力組相比，EVE作用早期EPAT內Lamin A/C的表達量顯著下降（P<0.05），Lamin B1、Lamin B2的表達則無明顯差異。進一步通過免疫化學檢測脂肪瓣切片中Lamin A/C的表達，結果可見（圖4 B），未施力組脂肪瓣內可見散在分布于脂肪組織的間質中的Lamin A/C陽性細胞，但EVE作用下脂肪瓣內Lamin A/C陽性細胞數量下顯著下降（P<0.01）。

圖4 脂肪瓣內差異表達的Lamins的篩選A：EVE組與對照組脂肪瓣內差異性Lamins的篩選 B：EVE組脂肪瓣內Lamin A/C的免疫組化染色圖及Lamin A/C陽性細胞數的統計分析圖（#和##代表不同時間點實驗組與對照組比較，P<0.05，P<0.01；**表示不同時間點實驗組組間比較，P<0.01；標尺=100 mm）Fig.4 The changes of Lamins expression during adipose tissue regeneration at different time pointsA:The changes of Lamins expression in both groups at indicated times;B:Immunohistochemical staining of Lamin A/C and quantification analysis of Lamin A/C-positive cells in both groups at indicated times(#,##indicated P<0.05 and P<0.01 experimental group compared with control group at different times,respectively;**indicated P<0.01,comparison of experimental group at different times;Scalebars=100 mm)

2.3 靜態應力通過激活Integrinβ1-Lamin A/C信號通路

通過“靜態拉伸系統裝置”將12%、6%、0%的形變分別作用于對照組和Integrinβ1敲低組ASCs，8 h后，通過免疫印跡檢測Lamin A/C在對照組和Integrinβ 1敲低組中ASCs內的表達程度。結果顯示（圖5），在不同細胞形變程度的刺激下,Integrinβ1敲低組ASCs細胞內Lamin A/C的表達量均高于對照組（P<0.05）。

圖5 Lamin A/C作為整聯蛋白β1下游蛋白負響應應力刺激對照組和整聯蛋白β1慢病毒敲低組，Lamin A/C的免疫印跡圖及免疫印跡灰度值統計分析圖（#和##表示不同時間點對照組與整聯蛋白β1慢病毒敲低組比較，P<0.05，P<0.01；*和**分別表示不同時間點的組間比較P<0.05，P<0.01）Fig.5 Inhibition of the Integrin β1 expression o in ASCs reversed the down-regulation of Lamin A/C expression by mechanical stressWestern blot analysis and quantification of Lamin A/C expression in ASCs in wild group and Sh-RNA integrinβ1 group(#,##indicated P<0.05 and P<0.01 control group compared with ShRNA-integrin β1 group,respectively;*,**indicated P<0.05 and P<0.01,comparison of control group at different times,respectively)

2.4 過表達Lamin A/C可逆轉靜態應力對ASCs的促增殖作用

通過“靜態拉伸系統裝置”將12%、6%、0%的形變分別作用于對照組和Lamin A/C過表達組ASCs，8 h后，通過細胞免疫檢熒光檢測Ki67在對照組和Lamin A/C過表達組中ASCs內的表達程度。結果顯示，在不同細胞形變程度的刺激下,Lamin A/C過表達組Ki67陽性ASCs細胞數低于對照組（P<0.05，圖6）。

圖6 Lamin A/C負性響應應力刺激調控ASCs增殖對照組和Lamin A/C慢病毒過表達組Ki67的免疫熒光染色圖及Ki67陽性細胞數的統計分析圖（#和##表示不同時間點對照組與Lamin A/C慢病毒過表達組比較，P<0.05，P<0.01；*和**分別表示不同時間點的組間比較P<0.05，P<0.01；標尺=100 mm）Fig.6 Over-expression of the Lamin A/Creversed the proliferation of ASCs by mechanical stress.Immunofluorescence staining of Ki67 and quantification analysis of the number of Ki67 positive cells in control group and Lamin A/C lentivirus over expression group(#,##indicated P<0.05 and P<0.01,control group compared with Lamin A/Cover-expression group,respectively;*,**indicated P<0.05 and P<0.01,comparison of the control group at different times,respectively;Scalebars=100 mm)

3 討論

脂肪組織工程室技術是修復大體軟組織缺損的新方案，其中力學誘導ASCs增殖是關鍵環節。本實驗證實，新型力學感受器核纖層蛋白Lamin A/C作為Integrinβ1下游分子，可響應力學刺激，并通過減低表達量負性調控ASCs增殖，繼而參與力學誘導的工程室化組織再生。

近年來，細胞核不僅作為細胞內硬度最高和基因轉錄發生的亞細胞結構，而且作為新型力學感受器/反應器，成為細胞生物力學領域的研究熱點之一。Lamin A/C不僅可以起到維持核內穩態和保護染色質的作用，同時也可以作為機械刺激細胞核內的反應器，將力學信號傳導至核內，可直接或間接參與基因的轉錄調控[10]。我們首次發現，脂肪組織內ASCs內Lamin A/C可負性響應力學刺激，并介導細胞增殖反應。與此類似的是，Qi等[11]探討了細胞核骨架蛋白Lamin A/C在高血壓高張應變誘導血管平滑肌細胞增殖中的作用及其機制，發現了Lamin A/C作為重要的保護性因子，其表達降低參與了高血壓高張應變誘導的血管平滑肌細胞異常，并提示有Lamin A/C可能作為高血壓血管重建的潛在靶標分子，具有重要的臨床轉化價值。

Lamin A/C作為Integrinβ1下游關鍵分子，負性調控ASCs增殖功能。至此我們證實細胞內力學傳導信號已基于細胞骨架系統從胞外傳導至胞核。Lamins通LINC復合體（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton complex）與細胞質骨架直接結合，同時可直接與染色質上DNA片段結合，這為細胞內力學信號的傳導提供了良好路徑[8]。與此同時，染色質作為化學信號中基因轉錄發生的核心部位，力學刺激能激活轉錄因子（transcription factor,TF）促進基因轉錄[9]。重要的是,Lamin A/C可與基因啟動子區域內的DNA序列或片段結合，可通過與DNA片段可逆性結合，調控TF轉錄[12]。因此Lanin A/C作為細胞核內力學感受器，起到了將力學信號化學化的關鍵作用。

本實驗首次證實了Lamin A/C作為Integrin軸下游關鍵分子，通過負性調控ASCs增殖參與力學誘導的工程室化組織再生過程。本實驗深入探討了工程室化組織再生過程中種子細胞ASCs擴增的分子機制，為脂肪組織工程室的臨床應用提供了參考依據。