白三烯B4在蛛網膜下腔出血后血管痙攣中作用的實驗研究

熊平 張濤 李崢

隨著蛛網膜下腔出血治療的不斷進步，致死率和致殘率有所下降，但其導致損傷的具體機制目前仍不十分清楚[1-3]。白三烯是一類具有高度生物活性的炎性介質，其合成主要有中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性及嗜堿性粒細胞等。其中白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）被證實為具有高度活性的中性粒細胞趨化因子，通過與白三烯B4受體1（BLT1）結合發揮趨化作用[4-6]。研究表明LTB4及BLT1可能參與了蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的發生發展[7-8]，具體機制不十分清楚。因此，本實驗探討LTB4在蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組SD大鼠由川北醫學院動物實驗中心提供。先將60只SD大鼠隨機分為正常組（NM組，6只），蛛網膜下腔出血組（SAH組，18只），蛛網膜下腔出血+LTB4抑制劑組（SAH+U75302 組，18 只），假手術組（Sham 組，18 只），其中SAH組、Sham組及SAH+U75302組依據時間節點又分為出血后1 d、3 d及5 d三個亞組，每組6只。采用枕大池二次注血法建立SAH模型，正常組不予任何處理，標準飼養，SAH組建模成功后予以標準飼養，SAH+U75302組建模成功后每天腹腔注射U75302（20 ng/d），Sham組建模成功后每天腹腔注射0.9%生理鹽水。本次造模中SD大鼠死亡8只，用SD大鼠進行補充。

1.2 標本采集各組分別于造模成功后1 d、3 d及5 d采集標本。先抽取血液標本，后采用4%多聚甲醛灌注，留取大鼠腦橋段（包含基底動脈）腦組織標本固定，后期行HE染色、免疫組化及血液中LTB4含量的測定。

1.3 HE染色常規行HE染色，并測量基底動脈管壁厚度及直徑。為減少誤差，采用校正直徑及校正血管壁厚度。校正直徑=（最長內徑×最短內徑）1/2，校正血管壁厚度=[（最長外徑-最長內徑）+（最短外徑-最短內徑）]/4[9-10]。

1.4 免疫組化染色采用二步法進行免疫組化染色，抗體選用Abcam公司的鼠抗單克隆NF-κB抗體，以核內棕黃色為染色陽性，在高倍鏡下選取5個視野，分別計算染色陽性細胞占所有細胞的陽性百分率，后取平均值作為NF-κB的表達情況。

1.5 大鼠血液中LTB4含量檢測采用ELISA法，按照試劑盒操作說明書檢測。

1.6 統計學方法采用SPSS 22.0進行分析。定量資料以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，多組均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 腦組織的大體觀察NM組及Sham組大鼠蛛網膜下腔未見血液，SAH組（圖1）及SAH+U75302組大鼠的腦溝、腦干腹側、基底池均可見有血液或血凝塊。

圖1 各組各時間點大腦組織的大體觀察 A.正常組，蛛網膜下腔未見明顯血液；B、C、D.分別為蛛網膜下腔出血組1 d、3 d及5 d腦溝、腦干腹側、基底池均可見有血液或血凝塊，且隨時間逐漸減少。

2.2 血管壁的病理學改變Sham組與NM組基底動脈內膜及外膜管壁平整，內皮細胞結構完整，內彈力膜未見明顯皺褶、斷裂。平滑肌細胞排列規整。SAH組及SAH+U75302組內膜出現皺褶呈現波浪狀改變，局部可有斷裂，中膜平滑肌細胞增生，平滑肌層增厚，可見粒細胞浸潤（圖2）。

圖2 各組各時間點基底動脈HE染色結果 A、H.NM組及Sham組 HE染色內膜及外膜管壁平整，內皮細胞結構完整，內彈力膜未見明顯皺褶、斷裂。平滑肌細胞排列規整。B、C、D.SAH組1 d、3 d、5 d 內膜出現皺褶呈現波浪狀改變，局部可有斷裂，中膜平滑肌細胞增生，平滑肌層增厚，可見粒細胞浸潤。E、F、G.SAH+U75302組1 d、3 d、5 d,血管壁的改變程度較SAH組輕。

2.3 基底動脈直徑見表1。各時間點Sham組與NM組比較，基底動脈直徑無明顯差異 （P均＞0.05）。各時間點Sham組、SAH組及SAH+U75302組基底動脈直徑有統計學差異（F=58.63、189.63、159.53，P均＜0.05），Sham 組基底動脈直徑均大于SAH組和SAH+U75302組，SAH組基底動脈直徑均小于SAH+U75302組。

2.4 基底動脈管壁厚度見表1。各時間點Sham組與NM組基底動脈管壁厚度無統計學差異（P均＞0.05）。各時間點 Sham組、SAH組及 SAH+U75302組基底動脈管壁厚度有統計學差異（F=22.93、314.01、490.94，P 均＜0.05），Sham 組基底動脈管壁厚度均小于SAH組、SAH+U75302組，SAH組基底動脈直徑均大于SAH+U75302組。

表1 各時間點大鼠基底動脈校正直徑及血管壁厚度（n=6）

2.5 大鼠血液中LTB4含量見表2。各時間點Sham組與NM組血液中LTB4含量無明顯差異（P均＞0.05）；各時間點 Sham組、SAH組及 SAH+U75302組血液中LTB4的含量有統計學差異（F=59.86、259.17、280.79，P 均＜0.05），SAH 組、SAH+U75302組大鼠血液中LTB4的含量較Sham組增高，SAH+U75302組LTB4的含量較SAH組減少。

2.6 基底動脈血管壁中NF-κB陽性細胞表達情況見表2。各時間點Sham組與NM組基底動脈血管壁中NF-κB陽性細胞百分率無統計學差異（P均＞0.05）。各時間點Sham組、SAH組及SAH+U75302組NF-κB陽性細胞百分率有統計學差異（F=198.32、854.57、1024.27，P 均 ＜0.05），SAH 組及 SAH+U75302組 NF-κB的表達較 Sham組增高，SAH+U75302組 NF-κB的表達較 SAH組減少。

表2 各時間點大鼠血液中LTB4含量及血管壁NF-kB陽性細胞百分率（n=6）

3 討論

目前越來越注重蛛網膜下腔出血患者早期腦損傷及血管痙攣機制的研究。其中蛛網膜下腔出血后血管痙攣的作用機制十分復雜。導致其出現血管痙攣的主要機制[11-13]目前公認的有：①免疫炎癥反應；②血管壁的結構和功能障礙；③血管舒張因子調節失衡；④血管內皮細胞凋亡；⑤血管活性物質的釋放，如血管緊張素、5-羥色胺、兒茶酚胺等；⑥自由基大量的生成，打破了自由基產生和清除的動態平衡。其中蛛網膜下腔出血后炎癥反應可能發揮主導作用[14-16]。近年來研究表明蛛網膜下腔出血后血液及腦脊液中LTB4含量明顯升高，BLT1在血管內皮細胞內有明顯表達，提示LTB4可能參與了蛛網膜下腔出血后的血管反應，但具體的作用機制不清楚[17]。

圖3 各組各時間點基底動脈 NF-κB 免疫組化染色結果 A、H.NM 組及 Sham；B、C、D.SAH 組 1 d、3 d、5 d；E、F、G.SAH+U75302組 1 d、3 d、5 d組血管壁NF-κB的表達情況。NM組表達較少，SAH組隨時間增加表達逐漸增加，SAH+U75302各組也隨時間表達逐漸增加，在內皮細胞，平滑肌層及外膜均有表達，SAH組與SAH+U75302組各時間點相比較，SAH+U7530組表達明顯減少（P<0.05）。

本實驗表明，各時間點SAH組基底動脈管壁厚度比NM組及Sham組厚（P<0.05），血管直徑均較NM組及Sham組小（P<0.05），表明蛛網膜下腔出血后大鼠基底動脈出現了血管痙攣，Sham組血管痙攣程度較SAH組明顯減輕，抑制LTB4能夠明顯改善血管痙攣程度。同時也在SAH組大鼠基底動脈壁中發現有大量粒細胞的浸潤，表明粒細胞可能參與了蛛網膜下腔出血后血管痙攣的發生。研究[18-19]表明粒細胞激活后會釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-1β（Interleukin-1β，IL-β），髓過氧 化 物 酶 （myeloperoxidase，MPO）以及核因-κB（nuclear-transcription factor-Kappa B，NF-κB）等。因而我們推測血管壁中大量存在的粒細胞可能是受到了LTB4的誘導趨化，使其血管內的粒細胞大量浸潤血管壁，粒細胞釋放大量的炎癥介質，促使多種炎癥通路激活，從而導致血管痙攣的發生。抑制LTB4，減少粒細胞的誘導趨化，從而改善血管痙攣。

LTB4作為一種具有高度活性的粒細胞趨化因子，而NF-κB在神經炎癥中處于中心地位，那么LTB4及NF-κB是否參與了血管痙攣的發生？在SAH組與SAH+U75302組各時間點中，血液中LTB4的含量及NF-κB的表達均比NM組及Sham組增加（P<0.05），SAH+U75302組與 SAH組相比LTB4的含量及NF-κB的表達減少（P<0.05）。我們推測蛛網膜下腔出血后，血液中的LTB4大量表達，趨化大量粒細胞通過某種途徑進入血管壁，具體途徑需進一步研究，同時粒細胞釋放大量NF-κB，激活NF-κB信號通路，導致血管痙攣的發生。炎癥介質導致血管痙攣機制不明確，有研究表明炎癥介質可導致血管平滑肌細胞發生表型轉化和血管重塑，從而導致血管痙攣[20-24]，但具體機制也需進一步研究。本研究表明，SAH+U75302組血管痙攣程度減輕可能是通過使用LTB4抑制劑，阻斷LTB4與BLT1結合，導致LTB4的趨化作用減弱，粒細胞進入血管壁減少，從而NF-κB釋放減少，抑制NF-κB介導的炎癥反應信號通路，從而減輕血管痙攣。

蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣目前還沒有特異的治療方案，抑制BLT4能夠改善血管痙攣程度，從而為臨床提供一種新的治療方式，與此同時BLT1特異性拮抗劑也具有潛在的臨床應用價值。