綜合生物信息學探究RNA結合蛋白對腎乳頭癌預后的影響

陳 趙，檀飛飛，劉同族

(1.武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.武漢大學人民醫(yī)院消化內科，湖北武漢 430071)

腎細胞癌(renal cell cancer，RCC)是泌尿系統(tǒng)高發(fā)的疾病之一，主要有5大分型，腎乳頭癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)是其發(fā)病率第2的分型。RNA結合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)是一種在細胞中穩(wěn)定表達的結合蛋白，它與多種編碼或非編碼RNA結合，對細胞的生長起調節(jié)作用。RBPs在人多種癌癥中被證明與預后相關，而在KIRP中的研究缺乏，故筆者就RBPs對腎乳頭癌的預后影響進行了探究，報道如下：

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載與處理從TCGA數(shù)據(jù)庫下載人腎乳頭癌基因表達樣本321個，包括32個正常樣本和289個腫瘤樣本，并提供相應的臨床信息。從GER等[1]的一次人類普查中收集了RBPs，總共獲得了1 542個RBPs基因(表1)。原始數(shù)據(jù)采用limma軟件包進行預處理。使用函數(shù)wilcox.test進行差異表達篩選，差異表達的RBPs以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false detection rate，F(xiàn)DR)<0.05和|logFC|≥0.5納入，F(xiàn)C為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。其中133個下調基因，259個上調基因(圖1)。

A:熱圖;B：下調基因的火山圖。

1.2 GO、KEGG富集分析使用R包“clusterProfiler”對差異基因進行了GO、KEGG富集分析，P<0.05被設為閾值標準，并使用R包“GOplot”對這些富集的結果進行了可視化處理。

1.3 蛋白網(wǎng)絡互作和可視化處理使用String(檢索相互作用基因/蛋白質的搜索工具)檢測了所有差異表達的RBPs之間的蛋白質-蛋白質相互作用(https://string-db.org/)，并使用Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 RBPs預后基因的篩選和預后模型的構建通過基于生存時間和生存狀態(tài)對差異基因進行了單因素Cox分析，通過kmPfilter<0.01篩選出預后相關的RBPs基因。對預后相關的RBPs基因進行多因素Cox分析篩選出獨立預后的RBPs基因，并建立了預后模型，隨后對模型進行生存分析，繪制風險曲線、受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線。

1.5 預后基因的免疫組化驗證為了進一步確定這些獨立預后基因在KIRP中的表達，使用了人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結果進行檢驗。

2 結 果

2.1 GO富集分析GO富集分析發(fā)現(xiàn)在生物學過程中，上調的差異基因(圖2A、C)主要富集在ncRNA代謝過程、核糖核蛋白復合物的生物發(fā)生、ncRNA處理、RNA剪接。下調的差異基因(圖2B、D)主要富集在翻譯的調節(jié)、RNA剪接、細胞酰胺代謝過程的調節(jié)。在細胞成分中，上調的差異基因主要富集在核糖體亞基、核糖體、大核糖體亞基；下調的差異基因主要富集在細胞質核糖核蛋白顆粒。在分子功能中，上調的差異基因主要富集在催化活性，作用于RNA、核糖體的結構成分；下調的基因主要富集在催化活性，作用于RNA、翻譯調節(jié)器活動。

A、B：上調的差異基因GO富集分析結果；C、D：下調的差異基因GO富集分析結果。

2.2 KEGG富集分析KEGG富集分析得出上調的差異基因(圖3A、C)主要富集在核糖體、剪接體、RNA轉運中，下調的差異基因(圖3B、D)主要富集在RNA轉運、mRNA監(jiān)測途徑中。

A、C：上調差異基因的KEGG富集分析結果；B、D：下調差異基因的KEGG富集分析結果。

2.3 PPI互作網(wǎng)絡為進一步探索這些差異基因的潛在分子功能及分子間相互作用，將差異基因導入string數(shù)據(jù)庫并用cytoscope可視化構建蛋白互作網(wǎng)絡，為方便展示，我們篩選了連接度大于20的進行展示，可以發(fā)現(xiàn)部分基因蛋白的相互作用預測關系(圖4)。

A:所有差異基因蛋白的相互作用；B：3個子網(wǎng)絡之間的相互作用。

2.4 四個獨立預后RBPs基因的Cox分析單因素Cox、多因素Cox分析篩選出PIWIL1、DALRD3、DNMT3B、TERT 4個獨立預后RBPs基因。其中DALRD3是低風險的預后基因，PIWIL1、DNMT3B、TERT是高風險的預后基因(圖5)。預后模型的生存分析得出高風險的患者其5年生存率遠遠低于低風險的患者，用于內部驗證的train組ROC曲線面積為0.944，外部驗證的test組ROC曲線面積為0.955，說明了該預后模型具有很高的預測價值(圖6)。風險曲線分析結果表明，根據(jù)模型評分，得分越高其生存率越低，反之亦然(圖7)。

A:28個RBPs基因的單因素Cox分析;B:6個RBPs基因的多因素Cox分析。

2.5 免疫組化和生存分析最后使用免疫組化展示了4個預后RBPs基因在腫瘤和正常組織中的蛋白表達水平?？梢钥闯?個高風險的基因(PIWIL1、DNMT3B、TERT)在腫瘤組織中的表達要明顯高于正常組織，低風險基因(DALRD3)在正常組織中的表達要高于腫瘤組織。同時我們還對4個預后基因進行了生存分析，結果表明在高風險的基因中表達水平越高生存率越低，而低風險的基因則顯示出了相反的結果(圖8)。

根據(jù)train組風險評分的中位值劃分高低風險組；A：train組高低風險組生存分析；B：train組ROC曲線；C：test組高低風險組生存分析；D：test組ROC曲線。

A：train組預后基因的熱圖；B：train組風險曲線；C：test組預后基因熱圖；D：test組風險曲線。

A：PIWIL1基因；B：DALRD3基因；C：DNMT3B基因；D：TERT基因。

3 討 論

RCC是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有癌癥的3%[2]。KIRP的發(fā)病率僅次于腎透明細胞癌。KIRP起源于腎近端的小管細胞[3]，其分為兩個亞型，1型預后相對較好，2型預后較差[4]。目前關于RCC的治療還是以手術為主，但是臨床上大約有30%的RCC患者會發(fā)生轉移[5]。對于轉移的RCC來說手術治療效果不佳，近年來關于預后標志物在設計診斷和預后測試方面研究越來越重視，預后標志物的發(fā)現(xiàn)對于RCC的治療來說具有重要的意義。

RBPs是一種可以和多種RNA結合的蛋白，可在細胞中穩(wěn)定表達，主要的作用是對RNA的加工，如對mRNA的剪接和對翻譯的調節(jié)等[6]。在過去的幾十年，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)RBPs與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間有著密切的關系[7-8]。因此本研究對KIRP和RBPs之間的關系進行了深入分析。

本文通過分析得出PIWIL1、DALRD3、DNMT3B、TERT這4個獨立預后的RBPs基因。其中PIWIL1是PIWI亞家族的成員，該蛋白在進化上是相對保守的蛋白，一項Meta分析的研究表明PIWIL1和多種癌癥的表達有相關性，其表達量越高患者的死亡率越高，且該研究還表明PIWIL1表達量越高的患者，其術后復發(fā)率越高[10]。SHI等[11]研究發(fā)現(xiàn)敲除PIWIL1基因可以大幅減少胃癌的轉移。我們推測其有可能成為KIRP預后標志物。DALRD3基因目的作用及功能國內外還沒有定論，本研究發(fā)現(xiàn)它是一個低風險基因，即其表達量越高患者的生存率越高，對于腫瘤患者來說是一個保護因素。DNMT3B是一個維持甲基轉移的酶，參與DNA甲基化以調節(jié)正常的生物學功能，其功能的異常通常與腫瘤的發(fā)生相關[12]。ZHU等[13]研究發(fā)現(xiàn)DALRD3通過調控RAD9表達來促進前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。還有研究表明DNMT3B的表達與黏液表皮樣癌的增殖有關[14]。結合我們的研究分析，DNMT3B有望成為KIRP的預后標志物。TERT是一種端粒酶的逆轉錄的酶，生物學功能就是維持染色體的穩(wěn)定，表達的失調可能與腫瘤的發(fā)生相關[15]。JUN等[16]研究發(fā)現(xiàn)TERT的表達促進了結直腸癌的發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)對于黑色素瘤來說，TERT突變的男性患者免疫治療的效果可能會更好[17]。這也給我們提供了新的思路，免疫和RBPs聯(lián)合分析可能會更加精確KIRP的治療靶點。

我們首創(chuàng)的KIRP-RPBs預后預測模型結果表明，風險評分越高的患者，其5年的生存率越低。對于本模型做了獨立預后分析，發(fā)現(xiàn)其可以作為獨立的預測因子。也就是說患者可以通過我們的模型計算出其風險評分，能夠初步計算出其5年生存率。盡管在每個步驟中都進行了嚴格的設計和過濾標準，但本研究仍存在一些局限性。首先，本研究僅納入了TCGA數(shù)據(jù)庫且樣本量較少。應該多中心，大量的納入樣本以確保研究的客觀性。其次，我們的實驗僅僅是數(shù)據(jù)分析層面，應加以實驗的驗證。

總之，我們通過一系列生物信息學分析得出了4個KIRP預后相關的RBPs，這4個基因有望成為KIRP潛在的生物預后標志物，并且我們還建立了KIRP患者的預后預測模型，希望本研究可以為臨床靶向治療KIRP提供一定的理論依據(jù)。