circRNA_000203與心力衰竭患者心功能及預后的關系研究*

劉國鑾,黃汝剛,楊彩霞,劉曉紅

鐵嶺市中心醫院循環內科,遼寧鐵嶺 112000

心力衰竭(簡稱心衰)是心功能異常引起心臟射血功能及心室充盈受損，最終導致心室泵血功能下降的臨床綜合征[1]。心衰患者的病死率較高，預后較差，生活質量受到嚴重影響[1-2]。深入分析心衰的病理機制并尋找潛在的生物學指標有重要意義。環狀RNA(circRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子，分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解[3]。有研究顯示，circRNA與心功能有關，能參與心衰的病情進展[4-5]。circRNA_000203在糖尿病小鼠心肌組織中表達上調，具有促纖維化作用。也有研究發現，circRNA_000203與心功能受損有關，可促進心肌肥厚[6]。外周血circRNA水平高于相應線性RNA水平，在血液中的水平高于肝臟、心臟和小腦組織，有可能成為血液標本中的分子生物學標志物[7]。本研究檢測了心衰患者血清中circRNA_000203表達水平，并分析了其與心衰患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2019年1月本院收治的124例急性心衰患者作為心衰組，其中男68例，女56例；年齡57～74歲，平均(64.01±9.79)歲；平均體質量指數(22.13±3.01)kg/m2；收縮壓(116.89±10.02)mm Hg；舒張壓(75.03±6.03)mm Hg；總膽固醇(4.47±1.35)mmol/L；三酰甘油(1.50±0.76)mmol/L。根據心衰患者紐約心臟病協會(NYHA)分級[8]：Ⅱ級36例，Ⅲ級45例，Ⅳ級43例；基礎疾病：瓣膜性心臟病37例，缺血性心臟病32例，高血壓性心臟病28例，擴張性心臟病27例。納入標準：(1)符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》中心衰的診斷標準[9]；(2)年齡≥18歲；(3)NYHA分級≥Ⅱ級；(4)隨訪資料完整。排除標準：(1)嚴重的肝腎功能異常；(2)合并急慢性感染；(3)腫瘤；(4)免疫系疾病；(5)精神疾病。

另選取同期本院體檢中心體檢的120例體檢健康者作為對照組，其中男61例，女59例；平均(62.89±10.12)歲；平均體質量指數(23.06±4.11)kg/m2；收縮壓(120.84±15.90)mm Hg；舒張壓(81.43±8.75)mm Hg；總膽固醇(4.26±1.47)mmol/L；三酰甘油(1.39±0.51)mmol/L。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經過本院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2血清circRNA_000203和氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平檢測 入組時抽取空腹靜脈血5 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，3 500 r/min離心5 min，留取血清于EP管中，并保存于-80 ℃冰箱中。熒光定量聚合酶鏈反應技術(FQ-PCR)檢測：用TRIzol試劑盒(上海百研生物科技有限公司)提取總RNA，隨后用Thermo Nano Drop3000紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，保證A260/A280比值在1.8～2.0。用反轉錄試劑盒(上海百研生物科技有限公司)將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA模板進行FQ-PCR(內參為GAPDH)，SYBRⅡ試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。實時熒光定量PCR檢測儀為美國ABI公司生產。以2-ΔΔCt表示circRNA相對表達水平[10]。引物序列：circRNA_000203上游 3′-CGA GCT GAG TGC GTC CTG TC-5′；下游′-TCG CTG GCC GTG AGT CTG T-5′；GAPDH上游5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′；下游5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。用UniCel DxI全自動化學發光儀及其配套試劑盒(美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測NT-proBNP水平。

1.3心功能檢測 用IE33彩色多普勒心臟超聲系統(荷蘭飛利浦公司)檢測受試者左心室射血分數(LVEF)、左心房內徑(LAD)、左心室舒張末期內徑(LVDd)。

1.4隨訪 對所有心衰患者進行門診和電話隨訪，納入研究的患者均獲得有效隨訪。心衰不良預后定義為再次發生心衰或死亡。

2 結 果

2.1兩組血清指標和心功能指標比較 心衰組circRNA_000203、NT-proBNP、LAD和LVDd高于對照組，而LVEF低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清指標和心功能指標比較

2.2不同NYHA分級心衰患者血清circRNA_000203表達水平比較 Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級心衰患者血清circRNA_000203相對表達水平分別為1.89±0.87、2.97±0.69、4.57±1.03，經方差分析，差異有統計學意義(P<0.001)，分級越高，血清circRNA_000203表達水平越高，見圖1。

注：與Ⅱ級患者比較，*P<0.05；與Ⅲ級患者比較，#P<0.05。

2.3心衰患者血清circRNA_000203表達水平與NT-proBNP、心功能指標的關系 circRNA_000203表達水平與NT-proBNP、LAD、LVDd呈正相關(r=0.678、0.411、0.409，P<0.05)，而與LVEF呈負相關(r=-0.555，P<0.05)，見表2。

表2 血清circRNA_000203表達水平與NT-proBNP、心功能指標的關系

2.4不同預后患者血清circRNA_000203表達水平比較 124例患者中預后不良44例，其中再發心衰30例，死亡14例。預后不良患者circRNA_000203相對表達水平為4.56±1.10，高于預后良好患者1.90±0.94，差異有統計學意義(t=13.544，P<0.05)，見圖2。

注：與預后不良心衰患者比較，*P<0.05。

2.5Logistic多因素分析心衰患者不良預后的影響因素 circRNA_000203、NT-proBNP、LAD、LVDd和LVEF是影響心衰患者預后的獨立因素(P<0.05)，見表3。

表3 Logistic多因素分析心衰患者不良預后的影響因素

續表3 Logistic多因素分析心衰患者不良預后的影響因素

2.6ROC曲線分析circRNA_000203預測心衰患者不良預后的價值 circRNA_000203預測心衰患者不良預后的AUC為0.756，當circRNA_000203取值為2.87時約登指數最大(0.539)，即診斷價值最高，此時靈敏度和特異度分別為65.03%和88.95%，見圖3。

圖3 ROC曲線分析circRNA_000203預測心衰患者不良預后的價值

3 討 論

心衰是臨床常見疾病，深入分析其發病機制并尋找潛在生物學標志物具有重要意義。circRNA在心衰中的作用引起了廣泛重視，例如心臟相關circRNA(HRCR)可以靶向作用于miR-223從而調控ARC基因表達，進而介導心肌肥大和心衰的發生[11]。本研究旨在分析circRNA_000203與心衰患者心功能及預后的關系。

circRNA廣泛存在于各種生物細胞中，可參與基因表達調控，具有穩定性、高度保守性和組織發育特異性[12]。circRNA通過外泌體分泌入血液，在不易獲取病理組織的疾病中，檢測外周血circRNA可能會作為一種新型診斷疾病的方法[12-14]。circRNA在心衰的診斷及鑒別診斷、病情評估和預后評估中顯示出了良好的應用前景[15]。既往研究顯示，circRNA_000203與心肌纖維化、心肌肥厚和結構重塑有關[6,16]。 但是鮮有研究檢測心衰患者外周血中該指標的表達及意義。本研究發現心衰患者circRNA_000203表達水平明顯高于健康者，并且NYHA分級越高，表達水平越高。提示circRNA_000203可能參與了心衰的發生。

circRNA_000203表達量與NT-proBNP、LAD、LVDd呈正相關關系，而與LVEF呈負相關關系，說明circRNA_000203有助于心功能的評估。circRNA_000203與心衰進展中的作用機制既往少有報道。TANG等[16]發現，circRNA_000203可能通過抑制miR-26b-5p、Col1a2和CTGF促進心肌纖維化。有研究顯示，circRNA_000203過表達會提高心室肌細胞心鈉素及β肌球蛋白重鏈的表達；在circRNA_000203轉基因小鼠中，用血管緊張素Ⅱ干預后，小鼠心臟功能受損，心肌肥厚加重，上述作用可能是circRNA_000203通過抑制miR-26b-5p和miR-140-3p引起GATA4表達上調而實現的[6]。本研究發現，circRNA_000203是心衰患者不良預后的獨立影響因素，預后不良患者circRNA_000203相對表達水平為4.56±1.10，高于預后良好患者1.90±0.94。另外，circRNA_000203預測心衰患者不良預后的AUC為0.756，提示該指標對早期預測心衰預后有一定價值。但是circRNA_000203預測心衰的靈敏度僅65.03%，可能與檢測手段、病情嚴重程度等有關，聯合其他指標進行預測可能會提高其診斷靈敏度。

綜上所述，心衰患者血清circRNA_000203表達水平升高，檢測其表達水平可能有助于評估心功能和患者預后。本研究也存在以下局限性：(1)本研究為回顧性研究，可能存在回憶偏倚和選擇偏倚；(2)未在患者入院時動態檢測circRNA_000203表達水平；(3)未分析circRNA_000203在心衰中的作用機制。未來需要開展細胞和動物研究進行深入分析。