液相懸浮陣列芯片在檢驗醫學中的應用進展*

李 敏，豆小文，熊 丹 綜述，張秀明△ 審校

1.安徽理工大學醫學院,安徽淮南 232000；2.深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗實驗室/深圳大學第三附屬醫院醫學檢驗科,廣東深圳 518001

隨著疾病精準診療需求提升，對于疑難性疾病，單一指標往往無法實現疾病的精準診斷，多指標聯合檢測早已成為臨床檢驗的常態。蛋白或基因芯片的產生為快速、準確、高效的臨床診斷、治療和預后監測提供了重要的技術手段。液相懸浮陣列芯片作為其中之一，已廣泛應用于微生物鑒定[1]、腫瘤標志物檢查[2]、藥物篩選[3-5]等領域。

20世紀90年代后期，液相懸浮陣列芯片技術作為后基因組新興分子生物學檢測芯片技術逐漸發展起來[6-8]，其是集基因芯片、流式細胞技術、激光分析以及數字信號處理等于一體的新技術。將小分子物質(如抗體、抗原、核酸探針等)致密地排列于特定載體微球(表面有不同的基團修飾，如羧基、羥基、生物素、鏈霉親和素等)上，利用分子間特異親和反應，實現對基因、配體、抗原等活性物質分析，從而達到多元檢測生物活性物質(超1 100種)或診斷多種疾病的目的。即可該技術的優勢在于所需樣本量僅微量足矣(10～50 μL)、適用樣本種類多且可同時定量多靶標等[9-10]。液相懸浮陣列芯片技術的首個商品化產品——靈活的多組分分析分子診斷技術平臺(xMAP)由美國Luminex公司研制成功，并通過了美國食品與藥物管理局(FDA)認證，于2005年度榮獲國際臨床診斷技術革新獎[11]。隨著該技術的發展，其已呈現出廣泛的臨床檢測應用前景。

1 液相懸浮陣列芯片技術原理

液相懸浮陣列芯片技術是基于xMAP技術和xTAG技術(二者均屬于Luminex公司)，核心采用載體編碼微球對待檢測目標物進行識別，載體編碼微球材料主要為聚苯乙烯、光子晶體等，微球直徑一般5.6 μm，表面標記不同熒光染料。

xMAP技術核心是將聚苯乙烯微球用不同比例的橙色和紅色熒光染料染色，根據二者熒光的比例不同可染成不同濃度的微球，還可添加第3種熒光染料，增加熒光編碼微球的數量。不同熒光編碼微球上共價偶聯相應的探針，混合在同一體系，再加入待測樣本。在液相懸浮溶液中，待測物質被熒光編碼微球上的探針識別并結合，結合了待測物質的熒光編碼微球一一排成單列被鞘液傳送系統傳送，依次被紅色和綠色激光激發。紅色激光用來激發熒光編碼微球本身的熒光，來識別微球的種類；綠色激光則用來激發報告分子攜帶的熒光，通過熒光強度實現待測物的定量分析[11]。xTAG是xMAP 技術的延伸，應用了Luminex專用的通用標簽，利用標簽和反標簽序列的互補配對對核酸試驗優化改進。運用PCR技術擴增待檢測物質的核酸，其產物與TAG引物混合，若存在目標核酸，則目標引物延伸并摻加入標記物，然后將帶有反TAG序列的微球加入反應體系中，微球通過專一的互補配對來識別目標引物。檢測鞘液系統中目標引物標記的熒光信號即可獲得分析結果[8]。隨著微球編碼技術、解讀編碼微球設備及編碼微球制備工藝改進，新型液相懸浮陣列芯片技術已在臨床檢驗應用領域發揮了愈加重要的作用。

2 微球編碼技術類型

編碼微球作為液相懸浮陣列芯片技術關鍵元件之一，目前以Luminex公司和BD公司的cytometric珠陣列系統[12]等商業化有機熒光染料編碼微球為主。此類微球應用范圍最為廣泛，但存在一些缺陷：(1)有機熒光染料發射光譜易與常用定量標記物發生干擾[13-14]，前者往往具有較寬的發射光譜；(2)有機熒光染料吸收光譜比較窄，檢測中需多束激光激發，成本較高[15]；(3)有機熒光染料易發生光漂白，不利于臨床應用。為了彌補有機熒光編碼微球的不足，越來越多的學者不斷研發出各種功能性納米顆粒編碼微球。

2.1上轉換熒光納米材料編碼微球 稀土摻雜上轉換熒光納米編碼微球是采用絡合共沉淀法、溶劑熱法或熱分解法摻雜Yb3+-Er3+、Yb3-Tm3+離子的β-NaYF4合成的編碼微球，可以在低能量下實現反Stokes發光，并在二極管近紅激光器激發下發出可見光(半高寬多發射峰小)[16-17]。相比于有機熒光染料，上轉換納米材料具有耐光漂白、低毒性等優點，因此上轉換熒光納米顆粒更適合用來編碼熒光微粒[18-20]。上轉換納米顆粒的多色發光是其待克服難題之一，有學者研究單發射峰上轉換納米材料可克服其劣勢，為該編碼材料臨床應用提供了可能[21-24]。

2.2量子點(QDs)編碼熒光微球 QDs又稱半導體納米顆粒，具有獨特光學特性：(1)同一激光可激發不同粒徑QDs，具有較寬激發光譜；(2)改變QDs形狀和化學組成可調節其發射光譜分布于整個可見光區；(3)具有較大Stokes位移，避免激發和發射光譜的信號重疊；(4)QDs效率高、熒光壽命長、生物相容性強等。QDs的編碼數量可利用公式實現多色編碼[25]。與有機熒光染料相比，雖然二者均采用短波長激發光，在檢測過程中產生較強背景噪聲，但QDs熒光壽命較長，故QDs編碼微球可通過時間分辨免疫與因短波激光產生的強背景干擾分開，實現高靈敏檢測的目的。

2.3熒光壽命編碼微球 熒光壽命是熒光染料的內參數[26]，將不同熒光壽命的靶向QDs混合，通過改變其組成比例，可獲得不同熒光壽命編碼微球，其編碼信息量大，是液相懸浮陣列芯片實現多元和特定分析的優異載體。由于流式細胞儀鞘液系統所需激光器一般3個以上，采用多元熒光壽命編碼微球檢測成本高，如何降低該載體的應用成本是未來需解決的核心問題。

2.4表面增強拉曼散射光譜(SERS)編碼微球 SERS由吸附于粗糙貴金屬Au、Ag、Cu等表面上吡啶分子實現液相體系中拉曼散射信號約6個數量級以上的信號增強[12，27]，已廣泛應用于生物傳感器和生物成像等技術。SERS具有以下優勢：(1)拉曼譜帶線寬極窄(約1 nm)，具有較強編碼能力；(2)靈敏度高，可以對單分子進行檢測；(3)拉曼散射壽命短，防止了其能量轉移、光褪色等，信號穩定性好；(4)所需激發光波長范圍寬。值得注意的是，在液相懸浮陣列芯片系統中，SERS信號易與熒光信號重疊，因此需謹慎選擇適宜的熒光標記分子和拉曼分子。

2.5結構色編碼微球 通過納米粒子有序組裝結構對光的反射和干涉，產生的一系列結構色的光子晶體(即電解質周期性排列結構)，也可作為編碼微球載體。光子晶體材料的結構周期性和折射率決定反射光的波長。由布拉格方程可知，光子晶體材料的顏色不易被漂白，且可調節。相比熒光編碼微球，結構色編碼微球(光子晶體)具有較好的穩定性和極低的檢測成本，在臨床疾病的診斷中有著強大的市場競爭力。

3 液相懸浮陣列芯片在臨床檢測中的應用研究

3.1病原體檢測 隨著新型分子生物學技術發展，熒光定量PCR、基因芯片、液相懸浮陣列芯片技術等已廣泛應用于病原體感染監測，見表1。液相懸浮陣列芯片可通過一次篩查即可實現快速、高效、特異、靈敏的多種病原體鑒別診斷，為臨床精準醫療決策提供可靠指導。

WANG等[25]基于新城疫病毒(NDV)蛋白和禽流感病毒(AIV)核蛋白包覆納米磁珠，采用1∶200最佳血清稀釋比建立雙相xMAP法，實現同時檢測NDV和AIV抗體，相比酶聯免疫吸附試驗(ELISA)靈敏度分別提高16和1 024倍。MARTIEZ-VENDRELL等[28]構建qSAT multiplex面板檢測全血、血漿中惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白2(PfHRP2)和瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)，所測PfHRP2和pLDH結果與定量PCR和顯微鏡測定的寄生蟲密度呈正相關關系，表明該法可預測寄生蟲密度。液相懸浮陣列芯片技術不僅可定量檢測病原體的抗原、抗體和核酸，還可定性鑒定病原體的血清分型。見表1。

表1 液相懸浮陣列芯片技術在病原體檢測中的應用

3.2自身免疫疾病標志物檢測 自身免疫性疾病在機體細胞受疾病刺激下可合成分泌具有生物學活性的小分子物質如抗核抗體譜、糖尿病譜、自免肝譜等，是疾病發生、進展和預后的良好指標，其檢測主要依賴ELISA、化學發光法，但這2種方法無法解決醫院多項目通量難題，當單項目標本量較小時，存在開瓶穩定性和試劑浪費問題，懸浮陣列芯片可多因子組合檢測，且具有高通量優勢，是自免標志物檢測的有力技術平臺。

GUO等[33]首次報道了利用懸浮陣列技術實現多位點的多路發光氧通道免疫分析平臺，設計了一種獨特的由QDs主珠(QDH)和位點受體珠(ABs)組成的主-客體雙功能條碼，QDH提供高編碼容量的功能，ABs促進發光氧通道免疫分析的功能。通過基于圖像的解碼，可以自動區分不同的條形碼，并利用位置信號進行共局域化，實現了在一個反應中同時檢測IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17A多個分析物。ZHENG等[34]建立圖形編碼的二氧化硅粒子平面襯底(25 μm×14 μm)的懸浮陣列芯片系統，編碼粒子薄膜涂層由高、低折射率交替介質材料(Si3N4和SiO2)周期性多層疊加而成。利用該系統成功創建GRASP assay法，可聯合檢測Ⅰ型糖尿病患者的胰島細胞抗原谷氨酸脫羧酶(GAD65)、胰島素瘤抗原2 (IA-2)和鋅轉運蛋白8 (ZnT8) 3種血清自身抗體。與臨床診斷結果比較，GRASP assay檢測靈敏度高達92.0%，特異度達100.0%。此外，產品化的全自動磁條碼多重液相芯片檢測平臺(MCLIA-800)，采用多層復合材料，以“棒狀”和“點狀”組合制備編碼多達4 096種的芯片，實現單管中同時進行17種抗核抗體的檢測，該體系具有高通量、高靈敏度、反應速度快、隨機進樣等特點。自身免疫性生物標記物臨床診斷應用研究尚在起步階段，隨著編碼微球、設備不斷改進，檢測成本降低，該技術在自免診斷領域有望發揮更大的應用價值。

3.3腫瘤標志物檢測 腫瘤篩查一般采用影像檢查技術，該法對惡性腫瘤患者的預后評估缺乏有效的參考價值，組織病理活檢作為金標準，對患者侵襲性極高。血清腫瘤標志物來源于腫瘤細胞或腫瘤微環境基質細胞，包括酶、蛋白質、激酶等，尤為適合人群普篩，液相懸浮陣列芯片技術在腫瘤標志物蛋白和游離核酸修飾等臨床檢測趨于流行。

XU等[35]基于反蛋白石光子晶體(PEGDA和瓊脂糖構成)編碼微球的液相懸浮陣列芯片技術檢測腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)。PEGDA構成的反蛋白石光子晶體能夠提供編碼信號和保證穩定性，且該結構空隙大利于分子的進出；瓊脂糖提供功能基團固定抗體，檢測限分別可達0.21 ng/mL和0.78 ng/mL。XIANG等[36]基于UiO-66-NH2金屬有機框架包裹在不同形態的微生物表面，形成用于檢測的新型微生物UiO-66-NH2復合材料而提出了的一種可識別形態的懸浮陣列。微生物賦予了復合材料不同形態和尺寸的條形碼能力，UiO-66-NH2具有穩定的剛性外殼、較大的比表面積和具有多個結合位點的金屬離子，可以簡化蛋白的固定化過程，實現了同時檢測結腸癌患者的miRNA-21、miRNA-17和miRNA-182核酸序列。此外，Luminex的Human Cancer Biomarkers液相懸浮芯片可對CA15-3、CA19-9、CA125、前列腺特異性抗原(PSA)等25種腫瘤標志物進行同步檢測，利用生物素-鏈霉親和素(BSA)和SA-PE熒光素實現微量因子的信號放大。液相懸浮陣列芯片作為腫瘤的普篩技術，不僅可大大縮減篩查檢測時間，為臨床提供輔助診斷依據，還可預判疾病發展的階段和程度，在腫瘤標志物檢測中具有巨大的應用潛力。

3.4其他生物活性物質的檢測 心血管疾病作為危害人類健康的一大慢性疾病，其篩查診斷指標眾多，液相懸浮陣列芯片技術可實現諸多心血管疾病生物標志物的聯合檢測，如冠心病可檢測的標志物有脂聯素/Acrp30、CD40、CD40配體等；急性心肌梗死可檢測的標志物有心臟肌紅蛋白、cTNI等。此外，可應用于糖尿病與代謝病生物標志物的檢測，如胰島素、胰島素C-肽、IGFBP-1、IGFBP-3、IGFBP-rp1/IGFBP-7等。液相芯片不僅可用于臨床疾病診斷，而且也可用于信號通路臨床研究，如IFN-γ、IFN-γR1、腎素、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF、M-CSF等小分子活性物質水平檢測。

4 展 望

液相懸浮陣列芯片技術可彌補傳統ELISA、化學發光技術的通量和組合檢測需求，具有高通量、準確、快速、靈敏的優勢。該技術具有廣闊臨床應用前景的同時也存在挑戰。例如：(1)國內熒光微球技術落后，具有高性能、高附加值的熒光微球材料被國外Luminex公司壟斷、占據著絕對龍頭地位；(2)血清中嗜異性抗體的存在可能干擾蛋白分析，牛血清清蛋白(BSA)作為一種阻斷劑可降低非特異性吸附克服背景信號增強，且不能連續監測樣品濃度；(3)國內相關領域的技術人才缺乏，諸多標志物組在臨床診斷的價值有待大樣本、多中心研究。

與此同時，液相芯片技術的應用還面臨諸多機遇：(1)與新型編碼微球技術、數字信號處理技術、抗體核酸技術等充分結合，實現同一個平臺多種臨床樣本分析；(2)有望在超過40個臨床診斷領域如基因突變研究、細胞因子、病原微生物等深入應用研究；(3)“床旁檢測”(POCT)診斷平臺臨床需求大，開發高通量微型液相懸浮陣列芯片技術實現POCT診斷是未來的趨勢。隨著醫院接診量提高，自動化檢驗需求加大，多指標聯合的高通量篩查需求不斷加大，液相懸浮陣列芯片技術多元化的發展與臨床疾病診斷的聯系越來越密切，液相芯片技術不僅可實現高通量、高精度、多項指標檢測，同時還減少了樣本量及檢驗人員工作量，在臨床診斷方面有著廣闊的應用前景。