不同前列腺特異性抗原檢測(cè)方法在前列腺癌根治術(shù)后隨訪中的應(yīng)用

韓志峰，谷費(fèi)菲，劉 晨，丁文潔

1.中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210002；2.中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210000

在接受前列腺癌根治術(shù)的患者中，術(shù)后10年復(fù)發(fā)率高達(dá)17.00%～53.00%，且大部分患者復(fù)發(fā)時(shí)多處于術(shù)后2～3年[1-2]。血清前列腺特異性抗原(PSA)是前列腺癌診斷的常用標(biāo)記物之一，在早期前列腺癌患者行前列腺癌根治術(shù)后，若血清PSA水平降低至谷底(最低值)后連續(xù)2次上升>0.2 ng/mL，則定義為生化復(fù)發(fā)[3]。生化復(fù)發(fā)要比臨床癥狀更早出現(xiàn)，且生化復(fù)發(fā)后的數(shù)月甚至數(shù)年才能通過影像學(xué)發(fā)現(xiàn)病灶，因此生化復(fù)發(fā)常被作為前列腺癌復(fù)發(fā)的最佳早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[4]。此外，術(shù)后隨訪中基于PSA水平的增高進(jìn)行干預(yù)，較臨床復(fù)發(fā)后干預(yù)更有助于改善患者的無癌生存率及預(yù)后。但目前常規(guī)PSA檢測(cè)存在一定弊端，前列腺癌根治術(shù)后有相當(dāng)一部分血清PSA濃度<1 pg/mL的患者未被檢測(cè)到[5-6]。本研究探討了超敏PSA免疫分析測(cè)定法在前列腺癌根治術(shù)后隨訪中應(yīng)用的可行性，以及現(xiàn)代超靈敏檢測(cè)技術(shù)是否可以提高此類患者的PSA監(jiān)測(cè)水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 將于中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院或東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院行前列腺癌根治術(shù)的20例術(shù)后患者的血清樣本進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合早期前列腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)及前列腺癌根治術(shù)適應(yīng)證[7]；(2)術(shù)后PSA濃度均<100 pg/mL；(3)患者知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并免疫性疾病或免疫缺陷；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并肝、腎功能不全等機(jī)體重要器官損害；(4)術(shù)后隨訪時(shí)間<2年，且連續(xù)收集血清次數(shù)<4次。入選患者均為男性，年齡51～72歲，中位年齡60歲。每例患者在5個(gè)術(shù)后隨訪時(shí)間點(diǎn)收集血清樣本，隨訪時(shí)間點(diǎn)的術(shù)后平均天數(shù)分別為79 d、302 d、616 d、810 d、1 021 d以及1 293 d，在中位隨訪時(shí)間3.5年內(nèi)(范圍2～6年)共收集了100個(gè)樣本，樣本檢測(cè)前均置于-80 ℃的環(huán)境中存放。患者確診時(shí)年齡、術(shù)前PSA水平等基本情況見表1。

表1 20例前列腺癌根治術(shù)患者的基本情況

1.2方法 分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)與超敏PSA檢測(cè)法測(cè)定患者術(shù)后不同時(shí)間的PSA水平。

1.2.1ELISA法 采用上海信帆生物公司生產(chǎn)的人PSA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書對(duì)同一組縱向樣本中的PSA水平進(jìn)行檢測(cè)，PSA水平為總PSA水平，包括了血清游離PSA和與α1-抗胰凝乳蛋白酶結(jié)合的PSA。所有的血清樣本均與8個(gè)校準(zhǔn)品一式三份進(jìn)行測(cè)量，來自同一患者的系列樣品在同一微孔板中運(yùn)行，以最大程度地減少技術(shù)差異。

1.2.2超敏PSA檢測(cè)法 采用基于電化學(xué)發(fā)光法的MesoScale Discovery來檢測(cè)血清中的復(fù)合PSA，試劑盒為羅氏公司生產(chǎn)的總PSA定量測(cè)定試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書操作，來自同一患者的系列樣品在同一微孔板中運(yùn)行，以最大程度地減少技術(shù)差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Pearson相關(guān)性系數(shù)分析超敏PSA檢測(cè)法的精度和準(zhǔn)確性，兩種檢測(cè)方法對(duì)生化復(fù)發(fā)的術(shù)后診斷時(shí)間差異采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，二分型的組織病理學(xué)資料比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，其余如年齡、術(shù)前PSA及Gleason評(píng)分等的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1超敏PSA檢測(cè)法的可靠性 采用超敏PSA檢測(cè)法成功對(duì)100個(gè)樣本的PSA水平進(jìn)行了定量分析，檢測(cè)下限(LLD)為0.003 pg/mL，重復(fù)測(cè)量的樣本之間具有極強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.99，P<0.01)。同時(shí)，96個(gè)(96.00%)重復(fù)測(cè)量樣本的批內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(CV)<10.00%，PSA濃度范圍為0.084～119.021 pg/mL，見圖1A。此外，使用ELISA僅在38個(gè)樣本中檢測(cè)到了PSA，LLD為1 pg/mL，超敏PSA檢測(cè)法測(cè)得的對(duì)應(yīng)樣本的PSA濃度與其具有極強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.91,P<0.01)，見圖1B。

圖1 超敏PSA檢測(cè)的可靠性散點(diǎn)圖分布情況

2.2兩種方法對(duì)血清PSA的縱向監(jiān)測(cè)情況 使用ELISA法檢測(cè)20例患者中有7例符合生化復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[3]，見圖2A。另外13例患者血清PSA未顯示連續(xù)的增高，其中有7例患者在所有隨訪時(shí)間點(diǎn)的PSA濃度無法測(cè)出，見圖2B。而超敏PSA檢測(cè)法檢測(cè)20例患者中有8例符合生化復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，見圖3A。另外12例患者血清PSA未顯示連續(xù)的增高，見圖3B。超敏PSA檢測(cè)法術(shù)后診斷生化復(fù)發(fā)的時(shí)間中位數(shù)為948 d，ELISA法為1 015 d，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 ELISA法檢測(cè)的血清PSA的縱向變化曲線

圖3 超敏PSA檢測(cè)的血清PSA的縱向變化曲線

2.3兩種檢測(cè)方法診斷生化復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者的臨床和病例學(xué)特征比較 兩種檢測(cè)方法診斷為生化復(fù)發(fā)患者的Gleason評(píng)分均明顯高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。其余如年齡、術(shù)前PSA、精囊受累、周圍組織浸潤(rùn)等臨床和病例學(xué)特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

注：有2例患者資料缺失，A為ELISA法，B為超敏PSA檢測(cè)法。

3 討 論

PSA監(jiān)測(cè)是前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的重要判斷工具，在關(guān)鍵時(shí)期開始實(shí)施挽救治療能最大程度改善預(yù)后。但很多患者的術(shù)后PSA采用常規(guī)ELISA法無法檢測(cè)到，PSA“缺失”可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)月或者數(shù)年，漏診的可能性較大[8-9]。隨著超敏PSA檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了檢測(cè)靈敏度，但應(yīng)充分分析因其帶來的優(yōu)勢(shì)及風(fēng)險(xiǎn)，以確保臨床決策基于可靠且有意義的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，并避免反復(fù)發(fā)作的過度診斷和過度治療。

MesoScale人復(fù)合PSA檢測(cè)法的LLD為0.003 5 pg/mL，是迄今為止報(bào)道最靈敏的PSA檢測(cè)方法之一，可與之比較的超敏PSA技術(shù)包括基于金納米顆粒、單分子陣列和基于超順磁珠的陣列測(cè)定(LLD 0.003～0.05 pg/mL)[10-12]。SCHUBERT等[11]報(bào)道，采用單分子陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)血清PSA水平>0.05 pg/mL時(shí)CV<20.00%，而PSA在1～50 pg/mL時(shí)則CV<10.00%，可見采用超敏PSA檢測(cè)法的精度更好。而本研究采用超敏PSA檢測(cè)法結(jié)果發(fā)現(xiàn)重復(fù)測(cè)量的樣本之間具有極強(qiáng)的相關(guān)性，測(cè)定PSA濃度最低值為0.084 pg/mL，而且測(cè)定的內(nèi)變異性較低、精度較高(96.00%的樣本CV<10.00%)，與既往采用ELISA法重復(fù)測(cè)定未經(jīng)稀釋血清樣品CV值<10.40%的報(bào)道一致[13]。在前列腺癌之外，眾所周知女性血清中PSA濃度較低(<1 pg/mL)，因此超敏PSA檢測(cè)還有望滿足各種醫(yī)學(xué)背景下女性PSA水平的監(jiān)測(cè)需求。

為了進(jìn)一步探尋低濃度(<1 pg/mL)的PSA動(dòng)力學(xué)是否能夠?yàn)樯瘡?fù)發(fā)提供臨床指導(dǎo)，本研究發(fā)現(xiàn)使用ELISA法監(jiān)測(cè)(LLD為1 pg/mL)時(shí)，有80.00%的前列腺癌患者在根治術(shù)后第1時(shí)間點(diǎn)均顯示PSA缺失，這些患者中有一半以上在術(shù)后約1～2年的隨訪中可檢測(cè)到PSA增加。同時(shí)，考慮到由于許多復(fù)發(fā)性前列腺癌病例會(huì)在2年內(nèi)出現(xiàn)[14]，因此在此期間監(jiān)測(cè)當(dāng)前無法檢測(cè)到的PSA理論上可以早期檢測(cè)某些患者的生化復(fù)發(fā)。此外，既往一項(xiàng)為期5年的隨訪研究表明[15]，ELISA分析靈敏度的提高使得生化復(fù)發(fā)的檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)分析方法早了18個(gè)月。而本研究結(jié)果則提示，超敏PSA檢測(cè)法盡管其靈敏度提高到了0.003 pg/mL，但與ELISA檢測(cè)術(shù)后生化復(fù)發(fā)的時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與前述報(bào)道并不一致，也可能與本研究的樣本量有關(guān)。

本研究采用超敏PSA檢測(cè)法在0.003～1 pg/mL范圍內(nèi)檢測(cè)PSA水平時(shí)，根據(jù)ELISA法評(píng)估為無生化復(fù)發(fā)的前列腺癌根治術(shù)患者中有1例(5.00%)符合生化復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，該例患者(P7)的所有血清樣本在使用ELISA法測(cè)定時(shí)均檢測(cè)不到PSA，而超敏PSA檢測(cè)法在術(shù)后第2個(gè)隨訪時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后250 d)至最后一個(gè)隨訪時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 297 d)的PSA測(cè)量值出現(xiàn)了穩(wěn)定升高，從0.32 pg/mL上升到4.40 pg/mL(圖3A)。說明單個(gè)患者在2.9年中的PSA增加了14倍，因?yàn)橄喈?dāng)?shù)偷腜SA濃度，基于此信息的臨床行動(dòng)應(yīng)保持懷疑態(tài)度。筆者建議仍然使用ELISA法監(jiān)測(cè)的臨床價(jià)值更高。

本研究結(jié)果還提示，患者之間和患者內(nèi)部PSA在<2 pg/mL時(shí)存在的較大幅度變化，這可能是由于生物學(xué)(日常)變化，例如分泌非前列腺組織的PSA。此外，有3例無生化復(fù)發(fā)的患者(P11、P16及P17)，PSA動(dòng)力學(xué)在<2 pg/mL的低水平下存在很大的不確定性，他們從最低點(diǎn)連續(xù)出現(xiàn)了2次PSA升高，總體升高幅度極大，然后在隨后的時(shí)間點(diǎn)該值急劇下降(圖3B)。很明顯，在如此低的濃度(<2 pg/mL)下PSA的變化可能不夠可靠，無法預(yù)測(cè)生化復(fù)發(fā)的征兆或觸發(fā)臨床決策。一項(xiàng)基于納米顆粒生物條形碼PSA分析(LLD為0.33 pg/mL)的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)[16]，<5 pg/mL的變化不能預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)，而PSA單調(diào)升高>5 pg/mL則可預(yù)測(cè)生化復(fù)發(fā)。結(jié)合本研究結(jié)果提示，ELISA檢測(cè)的性能似乎足以指導(dǎo)臨床操作。

將臨床病理信息與PSA監(jiān)測(cè)相結(jié)合對(duì)前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)具有重要意義。PSA濃度升高至標(biāo)準(zhǔn)閾值200 pg/mL以下僅可預(yù)測(cè)Gleason評(píng)分>8分、精囊浸潤(rùn)、手術(shù)切緣陽性及前列腺外擴(kuò)張等高危因素患者的復(fù)發(fā)[17]。而歐洲泌尿外科協(xié)會(huì)的新前列腺癌指南將復(fù)發(fā)的最主要不利預(yù)后因素確定為Gleason評(píng)分為8～10分，PSA倍增時(shí)間<1年[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Gleason評(píng)分較高與生化復(fù)發(fā)狀態(tài)相關(guān)，但與其他高風(fēng)險(xiǎn)因素之間沒有關(guān)系。可能歸因于本研究中包括的患者數(shù)量較少。

綜上所述，本研究超敏PSA檢測(cè)法能夠跟蹤血清PSA 0.003 5～1 pg/mL范圍內(nèi)的微小變化，比ELISA法靈敏度高，且對(duì)超敏PSA工具的技術(shù)實(shí)用性提供了全面報(bào)告。但在PSA低濃度下監(jiān)測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)結(jié)果不可靠，還是建議采用ELISA法進(jìn)行前列腺癌根治術(shù)后PSA的隨訪檢測(cè)。