肺炎克雷伯菌莢膜血清型、毒力基因和耐藥性研究*

施 瑜，王 震，張漢園，李 瑩

江蘇省鎮江市中西醫結合醫院檢驗科，江蘇鎮江 212000

肺炎克雷伯菌(KPN)是人和動物消化道及呼吸道的正常菌群，也是臨床重要的機會致病菌。近3年來CHINET細菌耐藥監測網的數據顯示，KPN已經成為臨床占比第二位的致病菌，對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在腸桿菌科中為最高，在25.00%以上[1-3]。根據KPN在瓊脂平板上的黏液性質可分為經典型肺炎克雷伯菌(cKP)和高黏液肺炎克雷伯菌(HvKP)，HvKP因其攜帶更多的毒力基因，具有比cKP更高的毒力，往往會引起較為嚴重的肺炎、敗血癥、眼內炎、壞死性筋膜炎和各臟器的膿腫等多部位的感染，嚴重者可導致死亡[4-5]，呈現出高毒力、高致病的特性。KPN的毒力因子包括莢膜多糖抗原、鐵攝入系統，菌毛的黏附作用等，包括有rmpA、magA、wcaG、fimH、kfu、Aero等毒力基因，這些毒力基因的表達都大大增加了KPN的侵襲力。本次研究重點對本院2019年1-9月臨床分離的KPN的黏液表型、莢膜血清型、毒力基因和耐藥性的相互關系進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1標本來源 收集本院2019年1-9月臨床分離的非重復菌株。所有菌株均經珠海迪爾的DL-96Ⅱ細菌鑒定系統鑒定為KPN，菌種保存于-80 ℃超低溫醫用冰箱中。藥敏結果參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)提供的(M100-S28)的標準來判讀。

1.2儀器與試劑 3110型CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)，-80 ℃超低溫醫用冰箱(海爾公司)、高速低溫離心機(湖南湘儀公司)，金屬干式加熱儀(Labnet公司)，mini 1610 PCR擴增儀(杭州朗基公司)，EPS-600電泳儀(上海天能公司)，紫外線凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；哥倫比亞血平板和中國藍平板(上海科瑪嘉公司)，Premix TaqTM Version 2.0 plus dye、DL2000 DNA標志物、瓊脂糖均購自日本Taraka公司，GoldviewⅠ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株復蘇、轉種、分純和鑒定 將保存于-80 ℃超低溫冰箱的菌種復蘇，轉種于血平板，35 ℃培養18 h，挑取血平板上單個菌落進行純培養，分純后的菌落經DL-96Ⅱ細菌鑒定儀鑒定為KPN，并進行藥敏試驗。所有鑒定均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第四版操作。

1.3.2質控菌株 大腸埃希菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603) 均購自江蘇省臨床檢驗中心。

1.3.3黏液絲試驗(ST) 用接種環蘸取菌落向上挑起，重復兩次。如黏液絲不能挑起或長度小于5 mm，判定為ST陰性；如黏液絲長度等于或超過5 mm則判定為ST陽性，即高黏液表型菌(HvKP)[6]。

1.3.4DNA模板制備 1.5 mL的EP管中加入400 μL SDS裂解液，用接種環挑取適量菌落于裂解液中混勻。置于金屬干式加熱儀中100 ℃加熱20 min，12 000 r/min,4 ℃高速離心10 min，上清液即為DNA模板，置于-20 ℃備用。

1.3.5莢膜血清型和毒力基因檢測 采用PCR法擴增K1、K2、K5、K20、K54、K57 6種主要莢膜血清型和rmpA、magA、wcaG、fimH、kfu、Aero 6種毒力基因。引物委托寶日醫生物技術(北京)有限公司合成。PCR反應體系為50 μL：Premix Taq plus酶25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 18 μL。擴增條件：95 ℃，預變性3 min、94 ℃變性40 s、50～59 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s、經35個循環，最后72 ℃延伸10 min。引物序列參考文獻[6-9]、退火溫度和產物長度見表1。取 PCR擴增產物10 μL進行1.50%瓊脂糖凝膠電泳120 V 80 min，在紫外凝膠成像儀上觀察結果。

表1 KPN的莢膜血清型和毒力基因引物序列

續表1 KPN的莢膜血清型和毒力基因引物序列

1.4統計學處理 采用Whonet 5.6軟件對細菌耐藥進行統計，采用SPSS25.0軟件進行統計分析。計數資料采用菌株數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1莢膜血清型和毒力基因分布 93株KPN中6種莢膜血清型和6種毒力基因均有檢出。其中K2型檢出率最高，為21.50%(20/93)，其次是K1型占13.98%(13/93)，K57型占8.60%(8/93)，K20型和K54型均占3.24%(3/93)，K5型占1.08%(1/93)。毒力基因中fimH占比最高，為96.80%(90/93)；其次是rmpA和Aero，均為64.52%(60/93)；magA僅在K1型中檢出；wcaG僅在K1和K54型中檢出。同時檢測到6種毒力基因的KPN菌株為13.98%(13/93)，全部出現在K1型中；同時檢出4種和3種毒力基因的分別為11.83%(11/93)和33.33%(31/93)，主要見于K2、K20、K54、K57型中；rmpA+fimH+Aero的組合最為多見，占33.33%(31/93)，有22株KPN只檢出1種毒力基因fimH。有2株KPN未檢測到上述6種莢膜血清型和6個毒力基因。見表2。PCR擴增產物見圖1。

表2 93株KPN的莢膜血清型和毒力基因的檢測結果[n(%)]

2.2不同黏液表型KPN的莢膜血清型與毒力基因比較 ST陽性株，即HvKP占51株(54.84%)，6種莢膜血清型在HvKP中均有檢出，為78.43%(40/51)；ST陰性株(cKP)為42株(45.16%)，除了K5和K57型，其余4種血清型在cKP中均有檢出，為19.05%(8/42)，主要莢膜血清型在不同黏液表型的檢出率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。毒力基因rmpA、wcaG和Aero在HvKP的檢出率明顯高于cKP，差異有統計學意義(P<0.05)，magA、fimH和kfu在二者的構成比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。HvKP中同時攜帶3種以上毒力基因者為86.27%(44/51)，高于cKP的26.19%(11/42)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同黏液表型KPN的莢膜血清型與毒力基因檢測結果[n(%)]

2.3不同黏液表型菌的藥敏比較 除氨芐西林對KPN的耐藥率為100.00%外，HvKP對常見抗菌藥物的耐藥率均低于cKP，沒有發現對亞胺培南、美羅培南、派拉西林/他唑巴坦、慶大霉素和阿米卡星耐藥的菌株。除亞胺培南和美羅培南外，其他12種常見抗菌藥物在兩者之間差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

注：M為DL2000 DNA標志物；1～6泳道分別為K1、K2、K5、K20、K54、K57血清型，片段長度分別是1 283、641、280、741、881、1 037 bp；7～12泳道分別是毒力基因wcaG、fimH、kfu、magA、rmpA和Aero，片段長度分別是169、688、797、1 283、536、556 bp。

表4 不同黏液表型KPN對抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]

續表4 不同黏液表型KPN對抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]

2.4多重耐藥菌與黏液表型、莢膜血清型和毒力基因的相關性比較 93株KPN中，檢出20株多重耐藥菌，其中產超廣譜β內酰胺酶(ESBLS)的KPN 18株(19.35%)，耐碳青霉烯類抗菌藥物的KPN 2株(2.15%)，多重耐藥菌在黏液表型、主要莢膜血清型、rmpA、magA、wcaG、Aero的檢出率均明顯高于耐藥菌，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 耐藥菌與敏感菌的莢膜血清型和毒力基因比較[n(%)]

3 討 論

自從20世紀80年代臺灣地區報道了可引起多處非傳統部位感染的HvKP以來[10]，越來越多的研究發現HvKP相較cKP而言，其細菌的黏液表型特征、致病特點都有很大的差異[11]。其主要特征是可引起健康人群、沒有基礎疾病的亞太人群的感染，同時具有從原始感染部位轉移至其他組織器官，從而導致遠端、不常見部位如眼和軟組織等處的感染，這在非免疫缺陷患者革蘭陰性桿菌的感染中非常罕見[12]。本次研究中，HvKP占54.85%，cKP占45.16%，本次分離的KPN以高黏液表型為主。

莢膜多糖(CPS)被認為是KPN最重要的毒力因子之一，CPS親水并帶有負電荷，與同樣帶有負電荷的吞噬細胞之間存在靜電相斥現象，可以阻滯和抵抗宿主吞噬細胞的吞噬和消化作用。根據CPS抗原的不同，可將KPN分為82個血清型[13]，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57型莢膜血清型與HvKP密切相關，是最常見的、毒力最強的型別，具有更強的致病性[14]。本次研究中6種莢膜血清型都有檢出，其中以K2型為主(21.50%)，其次是K1型(13.98%)和K57型(8.60%)。K1/K2/K57型在HvKP的檢出率(70.59%)明顯高于cKP(11.90%)，K57型只出現在HvKP中，與上海地區相似[15]。雖然K1/K2型主要見于高黏液表型中，但是在非黏液表型也有少量檢出，所以僅僅通過ST試驗可能會漏檢高產毒菌株，檢測人員需要通過PCR檢測莢膜血清型和毒力基因才能更好地篩選出產毒菌株。

6種毒力基因在13株K1型菌中全部都有檢出；其他5個型別同時攜帶3～4種毒力基因者(82.86%)明顯高于未分型者(30.95%)；HvKP組中同時攜帶3種以上毒力基因者(86.27%)明顯高于cKP組(30.95%)。此次研究證實了高毒力血清型攜帶有更多的毒力基因；K1型毒力相較其他莢膜血清型而言，毒力更強。攜帶有多種毒力基因的K1型與侵襲性綜合征(尤其在肝膿腫)密切相關[10]，實驗室需要加強對K1型KPN的監控。

本次研究發現，fimH在6種毒力基因中的檢出率最高，為 96.80%；其次是rmpA和Aero，均為64.52%，magA檢出率最低。fimH主要編碼Ⅰ型菌毛(TIP)蛋白[16]，fimH主要介導細菌的TIP與上皮細胞的甘露糖受體結合，使KPN黏附于宿主細胞上，同時還介導生成生物膜[17]，因為不參與黏液的形成，所以在HvKP株(98.04%)和cKP株(96.24%)的分布沒有差異，與相關報道一致[18]。rmpA作為黏液表型調節基因，屬于轉錄調控因子家族，在多種莢膜血清型的合成中起到正向調控作用[15]，形成高黏液表型，rmpA基因存在于219×103大質粒上，CHEN等[19]發現該毒力質粒上還同時表達包括Aero在內的多種毒力基因，HvkP株含有此毒力質粒，可協同調控HvKP毒力的形成，增加KPN的侵襲力；Aero編碼的是鐵載體中最為重要的氣桿菌素，可與宿主轉鐵蛋白中Fe3+結合形成螯合物，通過細胞膜上特定的鐵蛋白受體進入細菌體內，從而干擾宿主體內的鐵代謝，此外鐵載體還可以催化產生自由基，造成宿主組織細胞的損傷[20]。本次研究發現，所有rmpA陽性的菌株Aero也同時陽性，在HvKP株的檢出率(96.08%)明顯高于在cKP中的檢出率(26.19%)，在6種血清型的檢出率(95.83%)明顯高于非分型組(31.11%)，提示rmpA和Aero是KPN的主要毒力基因。magA是黏液相關基因，僅存在于K1型的質粒上，編碼K1型特異性的Wzy聚合酶[21]，是K1型莢膜生成的主要調控因子；wcaG編碼的基因產物是CPS中的巖藻糖，ZHENG等[22]發現wcaG不僅參與CPS的合成，還是KPN形成生物膜的一個獨立危險因素。本次研究發現，magA基因僅存在于K1型菌，證實了K1型和magA具有相關性，而wcaG基因只存在于K1和K54型中，與報道一致[23]。kfu編碼磷酸轉移酶系統的一些成分，有助于KPN攝入Fe3+，增強了KPN毒力[24]。

細菌耐藥方面，除了氨芐西林、亞胺培南和美羅培南的耐藥率在兩組KPN無差異外，HvKP的耐藥率明顯低于cKP。除了對氨芐西林的耐藥率為100.00%外，HvKP對其他抗菌藥物的耐藥率均較低，僅有1株HvKP產ESBLS，這株產ESBLS的HvKP為K2型，毒力基因的模式是rmpA+fimH+Aero。cKP中產ESBLS的檢出率為40.47%，只有1株為K20型，其余為未分型血清型，大多數只檢出1種毒力基因fimH；cKP中檢出2株CRE，均為未分型血清型，毒力基因的模式均為fimH+kfu。劉盼盼[25]研究發現，經亞胺培南體外誘導HvKP產生耐藥后，其高黏液表型消失、rmpA等毒力基因丟失、小鼠致死率下降、大多數毒力基因表達下調。本次研究中，多重耐藥菌的莢膜血清型的檢出率明顯低于敏感菌，除了fimH和kfu，其余4種毒力基因均存在明顯差異，究其原因，可能是KPN在獲得耐藥基因的同時丟失了質粒上的毒力基因，導致毒力基因的表達發生改變，從而引起表型和毒力的變異。

綜上所述，本次研究的KPN以HvKP為主，K1、 K2和K57型是本院常見的莢膜血清型，K1型所攜帶的毒力基因最多；rmpA和Aero是KPN的主要毒力基因；HvKP攜帶的莢膜血清型和毒力基因均明顯高于cKP，但是耐藥率明顯低于cKP。本次研究還發現了1株產ESBLS的高產毒菌，這種高產毒多重耐藥菌一旦侵入機體將會為臨床的治療帶來極大地挑戰，因此必須引起高度重視，應深入對此類菌株研究。