孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷易感性與MTHFR基因C667T位點(diǎn)突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變及血清SAP水平的關(guān)系*

唐明霞，解春寶

1.四川省雅安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川雅安 625000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，四川成都 610031

神經(jīng)管缺陷又稱(chēng)神經(jīng)管畸形，是一種嚴(yán)重的出生缺陷，危害嚴(yán)重，對(duì)家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)胎兒神經(jīng)管缺陷發(fā)生率約為2.74%，農(nóng)村較城市高，北方較南方高，秋冬季出生的嬰兒較春夏季出生的嬰兒高[2]。隨著醫(yī)療設(shè)備更新及醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，胎兒神經(jīng)管缺陷檢出率不斷上升。因此，篩查胎兒神經(jīng)管缺陷的高危因素，對(duì)指導(dǎo)育齡期女性?xún)?yōu)生優(yōu)育具有十分重要的意義。血清淀粉樣P物質(zhì)(SAP)為血清正常糖蛋白，亦為正五聚體蛋白家族中的重要成員，具有調(diào)控染色質(zhì)降解、參與細(xì)胞凋亡、參與先天性免疫應(yīng)答、參與創(chuàng)傷修復(fù)等作用[3]。已有研究顯示，神經(jīng)上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡與胎兒神經(jīng)管缺陷密切相關(guān)，而SAP具有調(diào)控神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡的作用[4]，因此推測(cè)SAP與胎兒神經(jīng)管缺陷可能有所關(guān)聯(lián)。葉酸代謝是妊娠過(guò)程中重要的生化反應(yīng)，涉及DNA合成、DNA甲基化、蛋白質(zhì)甲基化，如葉酸代謝失衡，可導(dǎo)致體內(nèi)生化反應(yīng)的紊亂，誘發(fā)胎兒神經(jīng)管缺陷形成[5]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和胸苷酸合成酶(TYMS)基因合成的蛋白均為葉酸代謝通路上的關(guān)鍵酶，都能影響葉酸代謝[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MTHFR基因C667T位點(diǎn)突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變均可導(dǎo)致葉酸代謝紊亂[7]，因此推測(cè)胎兒神經(jīng)管缺陷易感性與MTHFR基因C667T位點(diǎn)及TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變可能有所關(guān)聯(lián)。因此，本文探討了孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷易感性與MTHFR基因C667T位點(diǎn)突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變及血清SAP水平的關(guān)聯(lián)性，希望為臨床篩查神經(jīng)管缺陷高危人群提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年12月至2019年12月在四川省雅安市人民醫(yī)院(下稱(chēng)本院)產(chǎn)檢的159例胎兒神經(jīng)管缺陷的孕婦作為觀(guān)察組，159例胎兒健康的孕婦作為對(duì)照組。觀(guān)察組：年齡20～38歲，平均(27.85±3.65)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(28.50±2.36)kg/m2；孕周8～16周，平均(12.35±2.43)周；孕次1～4次，平均(2.57±0.72)次；產(chǎn)次0～3次，平均(1.23±0.38)次。對(duì)照組：年齡20～38歲，平均(28.11±3.12)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(28.44±2.25)kg/m2；孕周8～16周，平均(12.47±2.32)周；孕次1～4次，平均(2.66±0.83)次；產(chǎn)次0～3次，平均(1.30±0.41)次。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀(guān)察組孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷經(jīng)超聲檢查確診；(2)依從性好，能夠配合完成本研究?jī)?nèi)容；(3)無(wú)精神系統(tǒng)疾病；(4)心、肝、腎、肺、腦等重要臟器功能正常；(5)兩組受試者及其家屬對(duì)本研究充分知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并妊娠期并發(fā)癥、傳染性疾病、凝血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、甲狀腺功能異常、內(nèi)分泌疾病、心腦血管疾病、代謝性疾病；(2)雙胎或多胎妊娠；(3)非自然妊娠；(4)入院資料不全；(5)有早產(chǎn)、死產(chǎn)等不良妊娠史；(6)生殖器官異常；(7)宮頸功能不全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)中轉(zhuǎn)至上級(jí)醫(yī)院；(2)孕婦和(或)胎兒意外死亡。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2方法 兩組受試者入院后，記錄其年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒史、民族、吸煙史、文化程度、孕周、孕次、產(chǎn)次、等一般資料，采集次日清晨肘靜脈血2 mL，采用SpectrafugeTM6C血液離心機(jī)(北京蘭博康斯科技有限公司)，3 000 r/min離心15 min，分離血清，于-80 ℃條件下保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)血清SAP水平，儀器為上海昆士蘭生物科技發(fā)展有限公司提供的TECAN M1000多功能酶標(biāo)儀，試劑為上海晶抗生物工程有限公司提供的SAP檢測(cè)試劑盒。另采集次日清晨肘靜脈血4 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(上海圻明生物科技有限公司)中，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RLFP)法對(duì)MTHFR基因C667T位點(diǎn)、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，其具體操作如下：采用血液基因組DNA提取試劑盒(廣州吉賽生物科技股份有限公司)提取DNA，采用NanoUV-3000紫外分光光度計(jì)(東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司)對(duì)DNA定量，以DNA為模板，參照引物序列見(jiàn)表1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5 μL，MTHFR C667T位點(diǎn)上下游引物各1 μL，TYMS rs3819102位點(diǎn)上下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 16.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，循環(huán)45次。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用ExoI、FastAP純化，進(jìn)行延伸反應(yīng)，取1 μL延伸引物加至10 μL HiDi DNA Polymerase(深圳欣博盛生物科技有限公司)中，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，采用3500XL測(cè)序儀(北京埃克森科技有限公司)進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用Typer4.0軟件(深圳華因康基因科技有限公司)進(jìn)行分析，獲得目標(biāo)基因MTHFR、TYMS的基因型檢測(cè)結(jié)果。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組血清SAP水平 觀(guān)察組血清SAP水平為(31.19±0.45)mg/U明顯低于對(duì)照組的(42.05±0.69)mg/U，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.154，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組血清SAP水平比較

2.2兩組MTHFR基因C667T位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率 觀(guān)察組MTHFR基因C667T位點(diǎn)的CC、CT、TT基因型頻率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀(guān)察組MTHFR基因C667T位點(diǎn)的T、C等位基因頻率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組MTHFR基因C667T位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率[n(%)]

2.3兩組TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率 觀(guān)察組TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的AA、GG、AG基因型頻率較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀(guān)察組TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的A、G等位基因頻率較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率[n(%)]

2.4MTHFR基因C667T位點(diǎn)突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變及血清SAP水平與孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷的Spearman相關(guān)性分析 血清SAP水平與孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.647,P<0.05)；MTHFR基因C667T位點(diǎn)TT基因型頻率及T等位基因頻率與孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.205,P<0.05)；MTHFR基因C667T位點(diǎn)CC基因型頻率、CT基因型頻率及C等位基因頻率與孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷無(wú)相關(guān)性(r=0.050,P>0.05)；TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的GG基因型頻率及G等位基因頻率與孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.204,P<0.05)；TYMS基因rs3819102位點(diǎn)AA基因型頻率、AG基因型頻率及A等位基因頻率與孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷無(wú)相關(guān)性(r=-0.083,P>0.05)。

2.5孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 血清SAP低水平、MTHFR基因C667T位點(diǎn)T等位基因突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)G等位基因突變是孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4、5。

表4 孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷時(shí)血清SAP水平及MTHER基因的對(duì)比

表5 孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷時(shí)TYMS基因的對(duì)比

3 討 論

神經(jīng)管是胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)在胚胎形成15～17 d開(kāi)始發(fā)育，至胚胎形成22 d左右，神經(jīng)褶兩側(cè)互相靠攏而形成1個(gè)管道，稱(chēng)為神經(jīng)管，其尾端稱(chēng)為神經(jīng)管后孔，其前端稱(chēng)為神經(jīng)管前孔，在胚胎形成24～26 d時(shí)，前孔及后孔相繼關(guān)閉。神經(jīng)管缺陷是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)先天性畸形的疾病，病因涉及遺傳易感性、基因突變(如轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)基因、生長(zhǎng)因子及其受體基因、同型半胱氨酸代謝相關(guān)基因、蛋白激酶C相關(guān)基因、細(xì)胞連接類(lèi)基因、細(xì)胞骨架類(lèi)基因等)、妊娠早期人絨毛膜促性腺激素(HCG)合成減少、維生素B12缺乏、葉酸缺乏、妊娠早期用藥不當(dāng)、妊娠早期長(zhǎng)期高熱(>38.5 ℃)、妊娠合并糖尿病酮癥酸中毒、妊娠早期劇烈嘔吐等。胎兒神經(jīng)管缺陷主要表現(xiàn)為唇裂、腭裂、無(wú)腦兒、腦脊髓膜膨出、腦膨出、脊柱裂/隱性脊柱裂等，危害甚重。目前臨床多采用彩色多普勒超聲、核磁共振技術(shù)等對(duì)胎兒神經(jīng)管缺陷進(jìn)行篩查和診斷，但存在漏診、誤診等不足，局限性明顯。因此，如何更有效地評(píng)估胎兒神經(jīng)管缺陷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，仍需進(jìn)一步探討。

SAP為血清正常糖蛋白，能夠調(diào)控染色質(zhì)降解，還能與凋亡細(xì)胞結(jié)合參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程。有序的細(xì)胞凋亡對(duì)胚胎正常發(fā)育過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，如神經(jīng)管背腹構(gòu)型，但細(xì)胞凋亡極易受到各種因素干擾，引起胚胎發(fā)育異常而導(dǎo)致缺陷或畸形的發(fā)生。既往研究顯示，神經(jīng)上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡與胎兒神經(jīng)管缺陷密切相關(guān)[8]，因此推測(cè)SAP在胎兒神經(jīng)管缺陷的孕婦外周血中水平下降可能源于細(xì)胞過(guò)度凋亡。有研究報(bào)道[9]，SAP在細(xì)胞凋亡后可與核抗原結(jié)合而發(fā)揮清除致病性細(xì)胞碎片的作用，當(dāng)胎兒發(fā)生神經(jīng)管缺陷時(shí)，細(xì)胞大量凋亡，細(xì)胞碎片增加，大量SAP與這些細(xì)胞碎片結(jié)合，導(dǎo)致外周血中SAP水平降低。SAP亦為正五聚體蛋白家族中的重要成員，是體內(nèi)的急性時(shí)相蛋白，能夠參與先天性免疫應(yīng)答和創(chuàng)傷修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)，在慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，補(bǔ)體C4d、C3d激活少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而受損腦組織中的SAP水平與包覆少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的C4d、C3d補(bǔ)體水平相平行[10]，因此推測(cè)SAP參與補(bǔ)體激活途徑。另有研究發(fā)現(xiàn)，SAP在先天性心臟病房室間隔缺損患者外周血中呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與先天性心臟病房室間隔缺損患者免疫功能呈正相關(guān)關(guān)系，且SAP表達(dá)下調(diào)可提示肺部疾病易感性增加[11]。固有免疫在胚胎正常發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用，有研究推測(cè)SAP可能與固有免疫系統(tǒng)共同參與了胎兒神經(jīng)管缺陷形成[12]。本研究顯示，觀(guān)察組血清SAP水平明顯低于對(duì)照組，血清SAP低水平是胎兒神經(jīng)管缺陷的危險(xiǎn)因素，這與既往研究一致[13]，提示SAP在胎兒神經(jīng)管缺陷的孕婦外周血中呈低表達(dá)，SAP在胎兒神經(jīng)管缺陷形成過(guò)程中發(fā)揮著一定作用，SAP有望成為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒神經(jīng)管缺陷的血清生物標(biāo)志物。葉酸是一類(lèi)親水性的小分子，也稱(chēng)維生素B9，由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸、谷氨酸構(gòu)成，以8種輔酶形式存在于人體中，人體自身不能合成葉酸，需要外源性攝入，如從綠色蔬菜、柑橘類(lèi)水果、動(dòng)物內(nèi)臟、馬鈴薯等食物中攝取，吸收后的葉酸存于腸壁、骨髓、肝臟等組織中，被葉酸還原酶還原為具有廣泛生理活性的四氫葉酸(THFA)，從而參與嘌呤、嘧啶合成，因此葉酸具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成、正常紅細(xì)胞形成等作用，體內(nèi)葉酸缺乏時(shí)可致細(xì)胞成熟受阻、紅細(xì)胞中血紅蛋白合成減少[14]。葉酸代謝是妊娠過(guò)程中重要的生化反應(yīng)，涉及DNA合成、DNA甲基化、蛋白質(zhì)甲基化，如葉酸代謝失衡，可導(dǎo)致體內(nèi)生化反應(yīng)的紊亂，誘發(fā)胎兒神經(jīng)管缺陷形成。MTHFR、TYMS基因合成的蛋白均為葉酸代謝通路上的關(guān)鍵酶，都能影響葉酸代謝。MTHFR是細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng)過(guò)程中的限速酶，TYMS是催化脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成的唯一產(chǎn)物，若二者基因突變，均可造成葉酸代謝紊亂。有研究指出，TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變可影響脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)向dTMP轉(zhuǎn)化而增加胎兒出現(xiàn)神經(jīng)管畸形的可能性，因此TYMS基因rs3819102位點(diǎn)突變與胎兒神經(jīng)管缺陷關(guān)系密切[15]。有報(bào)道指出，MTHFR基因C667T位點(diǎn)突變可導(dǎo)致葉酸代謝紊亂，增加胎兒神經(jīng)管缺陷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16]。本研究對(duì)MTHFR基因C667T位點(diǎn)、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行了較為詳細(xì)的分析，發(fā)現(xiàn)觀(guān)察組MTHFR基因C667T位點(diǎn)的TT基因型頻率及T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，觀(guān)察組TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的GG基因型頻率及G等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，由此猜測(cè)孕婦MTHFR基因C667T位點(diǎn)的TT基因型頻率及T等位基因頻率增加，TYMS基因rs3819102位點(diǎn)的GG基因型頻率及G等位基因頻率增加，提示其胎兒可能具有神經(jīng)管缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。本研究Logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C667T位點(diǎn)T等位基因突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)G等位基因突變是孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷的危險(xiǎn)因素，提示MTHFR基因C667T位點(diǎn)T等位基因突變及TYMS基因rs3819102位點(diǎn)G等位基因突變可能增加孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷易感性。該結(jié)論有助于闡明孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷的分子遺傳學(xué)機(jī)制，為基因水平上預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供新的方向，臨床醫(yī)師應(yīng)針對(duì)上述因素加強(qiáng)防控，積極做好篩查工作，以降低孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，血清SAP低水平、MTHFR基因C667T位點(diǎn)T等位基因突變、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)G等位基因突變可能增加孕婦胎兒神經(jīng)管缺陷易感性。但除了臨床研究較為廣泛的MTHFR基因C667T位點(diǎn)、TYMS基因rs3819102位點(diǎn)外，是否還存在其他多態(tài)性位點(diǎn)協(xié)同影響胎兒神經(jīng)管缺陷發(fā)生，仍需進(jìn)一步研究。