大黃牡丹湯聯合柳氮磺胺吡啶腸溶片對潰瘍性結腸炎小鼠氧化應激及Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1-核因子E2相關因子2信號通路的影響※

滿光亮 劉永艷 梁國強

(江蘇省昆山市第四人民醫院消化科,江蘇 昆山 215300)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)屬于炎癥性腸病的一種常見類型，臨床表現為腹瀉、黏液膿血便、腹痛等，且容易反復發作，對患者的生活質量造成嚴重影響[1]。UC的發病機制尚不十分明確，有研究認為其發病與遺傳、環境、免疫等多種因素相關，其中氧化應激也是UC發病的重要機制之一[3]。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1-核因子E2相關因子2(Keap1-Nrf2)信號通路是細胞氧化應激反應中的關鍵通路，其調控的下游二相代謝酶和抗氧化蛋白酶在細胞防御保護中發揮著重要作用，也是近幾年抗氧化研究領域的熱點[4]。中醫藥在UC的治療方面具有獨特優勢，認為UC的發生多是因脾虛失運，濕熱熏蒸，氣血相搏結，導致腸道氣凝血滯，腐敗成膿下所致[5]。大黃牡丹湯源自《金匱要略》，具有瀉熱逐瘀、消腫散結、涼血止血的功效。有研究表明，大黃牡丹湯可通過抑制炎性反應對UC發揮治療作用[6]。為進一步發揮中醫優勢，探索大黃牡丹湯治療UC的機制，本研究觀察大黃牡丹湯聯合柳氮磺胺吡啶腸溶片對UC小鼠氧化應激及對Keap1-Nrf2信號通路的影響，結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級BALB/c小鼠50只，雄性，周齡6～8周，體質量18～20 g，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2018-0006。

1.2 主要藥物 大黃牡丹湯：大黃12 g，牡丹皮9 g，桃仁12 g，冬瓜仁30 g，芒硝9 g(均采用江陰天江藥業有限公司生產的中藥顆粒劑)；葡聚糖硫酸鈉鹽(美國MPBIO公司)；柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業有限公司，國藥準字H31020557)。

1.3 主要試劑 蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒(鴻泉生物科技有限公司)；小鼠活性氧(ROS)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒、小鼠髓過氧化物酶(MPO)ELISA試劑盒、小鼠丙二醛(MDA)ELISA試劑盒、小鼠總抗氧化能力(T-AOC)ELISA試劑盒及小鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；Anti-Keap1抗體、Anti-Nrf2抗體及其相關免疫組化檢測試劑盒(英國Abcam公司)。

1.4 主要儀器 CX41生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；數碼相機[NIKON(D5100)公司]；Infinite F50酶標儀(瑞士Tecan公司)；Image pro plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)；低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 造模、分組及給藥方法 將50只小鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為空白組、模型組、西藥組、中藥組及中西藥組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠參照文獻[7]采用葡聚糖硫酸鈉鹽誘導制備UC模型，連續飲用5%葡聚糖硫酸鈉鹽溶液7 d即可建立小鼠UC模型。造模成功觀察3 d后，空白組及模型組予雙蒸水灌胃10 mL/kg灌胃，西藥組予柳氮磺胺吡啶腸溶片藥液0.8 g/kg灌胃，中藥組予大黃牡丹湯顆粒劑5.7 g生藥/kg灌胃，中西藥組上午予柳氮磺胺吡啶腸溶片藥液灌胃，下午予大黃牡丹湯顆粒劑灌胃，灌胃劑量分別同西藥組和中藥組，均每日1次，連續灌胃7 d。

1.5.2 標本的采集和處理 各組大鼠末次灌胃后禁食不禁水24 h，然后頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔，游離結腸及遠端回腸，取出肛門至盲腸末端的整個腸段，迅速沿著腸系膜縱軸剖開，刮取收集腸內容物(黏膜黏液)，-80 ℃保存備用。再用預冷0.9%氯化鈉注射液漂洗干凈，將結腸平展開，仔細觀察腸道潰瘍和炎癥情況，剪取潰瘍最嚴重處結腸組織約1.5 cm，等分2份,一份-80 ℃保存備用，另一份用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，備用。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 一般情況 觀察各組小鼠灌胃期間的一般情況，包括精神狀態、毛色、體質量、排便等，并根據小鼠糞便性質及隱血情況對灌胃后疾病活動指數(DAI)評分進行比較[8]。0分：大便正常，隱血陰性；1分：軟便，隱血陰性；2分：軟便，隱血陽性；3分：腹瀉，隱血陽性；4分：腹瀉，血便。

1.6.2 結腸組織病理學觀察 各組小鼠隨機取5個結腸組織切片樣本進行HE染色，然后在生物顯微鏡下(×400)觀察小鼠結腸組織病理變化情況，并進行結腸黏膜損傷指數(CMDI)評分比較，包括潰瘍、炎癥、肉芽組織、病變深度及纖維化5個方面，評分越高說明損傷越嚴重[9]。

1.6.3 Keap1和Nrf2蛋白表達檢測 各組小鼠隨機取5個結腸組織切片樣本進行免疫組化染色，然后計算小鼠結腸組織Keap1和Nrf2蛋白表達的平均光密度值。首先按照Keap1和Nrf2的免疫組化檢測試劑盒說明進行免疫組化染色，然后在生物顯微鏡下(×200)觀察陽性染色，截圖，再用Image pro plus 6.0圖像分析軟件分析Keap1和Nrf2蛋白表達的平均光密度值。

1.6.4 氧化應激指標 取各組小鼠備用腸內容物及結腸組織，稱質量，分別加入9倍質量的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，再用低溫冷凍離心機以3 000 r/min，4 ℃，離心10 min，分別采用ELISA測定腸內容物ROS水平和結腸組織MPO、MDA、T-AOC、GSH水平，均嚴格按照試劑盒說明進行。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況及DIA評分比較 空白組小鼠灌胃期間精神狀況好，飲食、飲水及排便情況均正常，活動敏捷，毛發順滑光亮，體質量隨時間正常性增長。模型組小鼠隨著時間增加飲食、飲水逐漸減少，毛發雜亂，精神狀態差，出現持續性松散血便，體質量下降。西藥組、中藥組和中西藥組在灌胃給藥前一般狀況表現與模型組一致，在灌胃治療后上述癥狀均有所改善。另外，實驗過程中模型組有2只小鼠死亡，西藥組和中藥組各有1只小鼠死亡，分析原因主要與造模相關，與文獻報道存在一定的死亡率相一致[7]。各組小鼠灌胃后DIA評分比較 見表1。

表1 各組小鼠灌胃后DAI評分比較 分，

由表1可見，與空白組比較，模型組小鼠DAI評分升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥組和中西藥組小鼠DAI評分均降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，西藥組雖也有下降但比較差異無統計學意義(P>0.05)。西藥組、中藥組和中西藥組小鼠DAI評分組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠結腸組織病理學觀察及CMDI評分比較 空白組小鼠結腸組織黏膜完整，腺體排列整齊，未見潰瘍。模型組小鼠結腸黏膜有缺損，腺體結構分離，大量中性粒細胞浸潤，出現炎性反應，可見肉芽組織增生及纖維化，病變深度集中在肌層及漿膜層，說明已經造成了結腸黏膜深層損傷。相對模型組，西藥組、中藥組和中西藥組結腸組織的病理學表現均有不同程度的改善。見圖1。各組小鼠CMDI評分比較 見表2。

由表2可見，與空白組比較，模型組小鼠CMDI評分升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，西藥組、中藥組和中西藥組小鼠CMDI評分均降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與西藥組和中藥組比較，中西藥組小鼠CMDI評分均降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，西藥組與中藥組組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠CMDI評分比較 分,

2.3 各組小鼠結腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值比較 見表3、圖2、圖3。

由表3可見，與空白組比較，模型組小鼠結腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值的升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，西藥組、中藥組和中西藥組Keap1蛋白平均光密度值均降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05),西藥組Nrf2蛋白平均光密度值有下降趨勢，中藥組和中西藥組Nrf2蛋白平均光密度值有增高趨勢，但比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與西藥組比較，中西藥組Keap1蛋白平均光密度值降低，Nrf2蛋白平均光密度值升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與中藥組比較，中西藥組Keap1蛋白平均光密度值降低，比較差異有統計學意義(P<0.05)，Nrf2蛋白平均光密度值有升高趨勢，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠結腸組織病理觀察(HE，×400)

表3 各組小鼠結腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值比較

圖2 各組小鼠結腸組織Keap1蛋白表達情況(免疫組化，×200)

圖3 各組小鼠結腸組織Nrf2蛋白表達情況 (免疫組化，×200)

2.4 各組小鼠ROS、MPO、MDA和T-AOC、GSH水平比較 見表4。

表4 各組小鼠ROS、MPO、MDA和T-AOC、GSH水平比較

由表4可見，與空白組比較，模型組小鼠ROS、MPO和MDA水平均升高，T-AOC水平降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，GSH水平有下降趨勢，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，西藥組、中藥組和中西藥組ROS和MDA水平均降低，T-AOC水平均升高，西藥組和中西藥組MPO水平均降低，中藥組和中西藥組GSH水平均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，中藥組MPO和西藥組GSH水平與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與西藥組比較，中西藥組ROS和MDA水平均降低，T-AOC和GSH水平均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，MPO水平有升高趨勢，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。與中藥組比較，中西藥組ROS、MPO和MDA水平均降低，T-AOC水平升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，GSH水平有升高趨勢，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

UC又稱為慢性非特異性潰瘍性結腸炎，是一種多因素、多層次、病因不明的非特異性腸道炎癥，臨床表現為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便等消化道癥狀，以及發熱、水電解質紊亂、貧血、體質量下降等全身癥狀[10]。UC病情常反復遷延不愈，其發病機制復雜，一直是學界的研究熱點，臨床上研究較多的機制包括遺傳因素、感染因素、環境因素、飲食結構因素、免疫因素等，近年來氧化應激對UC發病的影響也逐漸受到關注[11]。氧化應激是體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態。正常情況下機體內的氧化過程與抗氧化過程處在動態平衡的狀態，一旦這種平衡受到破壞，受氧化應激作用的刺激或損傷,體內ROS分泌會明顯增多，而過量的ROS會造成機體細胞功能紊亂和損傷，誘發炎性反應[12]。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的氧化終產物，作為過氧化反應的代謝產物之一，其可以反映過氧化程度，也可以間接反映細胞損傷的程度[13]。MPO是一種由中性粒細胞表達并分泌的過氧化物酶，具有強效的促炎作用，并且可能直接參與組織損傷[14]。GSH是含有巰基的三肽化合物，在人體內具有活化氧化還原系統的生理活性，是體內一種重要的抗氧化劑，其通過巰基與自由基結合，直接使自由基還原成酸性物質，從而加速自由基的排泄，并對抗自由基對組織細胞的損害[15]。T-AOC是指體內各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平，其水平越高表示機體抗氧化的能力越強[16]。Nrf2是機體抗氧化應激體系中的一類關鍵轉錄因子，同時也是維持細胞內氧化還原穩態的中樞調節者,其參與的Keap1-Nrf2信號通路被認為是機體參與抗氧化的最重要的通路之一[17]。正常情況下,存在于細胞漿中的Nrf2與胞質接頭蛋白Keap1緊密結合，從而處于相對靜止狀態，但在機體受到氧化應激的作用下,Nrf2會迅速與Keap1分離后活化進入細胞核內,進而調控下游多種抗氧化酶如GSH等參與到清除氧化應激產生的有害物質的過程，Keap1-Nrf2信號通路介導的防御機制對正常細胞具有保護作用，在對抗多種疾病的病理狀態中發揮著至關重要的作用[18]。本研究結果顯示，模型組小鼠造模后飲食、飲水逐漸減少，毛發雜亂，精神狀態差，出現血便，體質量下降，結腸組織病理觀察也顯示結腸黏膜缺損，腺體結構分離，大量中性粒細胞浸潤，出現炎性反應，可見肉芽組織增生及纖維化，DIA評分及CMDI評分較空白組均明顯升高(P<0.05)，說明UC模型造模非常成功；氧化應激指標中ROS、MPO和MDA水平較空白組明顯升高(P<0.05)，T-AOC水平明顯降低(P<0.05)，且結腸組織Keap1和Nrf2蛋白平均光密度值明顯升高(P<0.05)，說明機體處于氧化應激過度的狀態。

UC屬于中醫學臟毒、泄瀉、腸風、痢疾等范疇，認為本病多由于外感濕熱，或飲食內傷，或勞倦過度，導致脾胃受損，運化失司，水濕內聚，日久生熱，濕熱蘊結，下注大腸，濕熱浸淫，氣滯血瘀，損傷腸絡，導致血敗肉腐，發為潰瘍[19]。大黃牡丹湯是治療腸癰初起，濕熱瘀滯的經典名方，方中大黃逐瘀瀉下，解毒攻積；牡丹皮清熱涼血，活血散瘀；桃仁性善破血，活血逐瘀；冬瓜仁清熱利濕，排膿消癰；芒硝滌蕩實熱，軟堅散結，使壅滯邪熱自腸而出。全方集瀉下、清熱、利濕、逐瘀于一體，諸藥合用，濕熱得清，血滯得散，腸腑得通，則癰消痛止。現代藥理學研究表明，大黃牡丹湯可通過抑制外周血中性粒細胞增殖、提高紅細胞數和血紅蛋白含量、提高免疫功能等發揮對UC的治療作用[6，20]。柳氮磺胺吡啶屬于氨基水楊酸類藥物，是目前臨床上治療UC的一線用藥，可通過消除氧自由基、抑制炎性反應等途徑起到治療作用[21]。本研究結果顯示，與模型組比較，西藥組予柳氮磺胺吡啶腸溶片灌胃干預后ROS、MPO、MDA及T-AOC水平均明顯改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明顯降低(P<0.05)；中藥組予大黃牡丹湯灌胃干預后ROS、MDA、T-AOC及GSH水平均明顯改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明顯降低(P<0.05)；中西藥組予聯合干預后ROS、MPO、MDA、T-AOC及GSH水平均有明顯改善(P<0.05)，Keap1蛋白平均光密度值明顯降低(P<0.05)，且中西藥組對ROS、MDA、T-AOC水平及Keap1蛋白平均光密度值改善程度均優于西藥組和中藥組(P<0.05)，對GXH及Nrf2改善優于西藥組(P<0.05)，對MPO改善優于中藥組(P<0.05)。說明柳氮磺胺吡啶腸溶片和大黃牡丹湯對UC模型小鼠均有抗氧化作用，且兩者聯合應用具有協同效應，可進一步提高療效。

總之，氧化應激損傷是UC發病的重要機制，臨床主要表現為持續性松散血便，結腸組織病理可見黏膜損傷，炎癥細胞浸潤，肉芽組織增生及纖維化，病變深度集中在肌層及漿膜層。大黃牡丹湯和柳氮磺胺吡啶腸溶片對UC均有確切的治療作用，可改善小鼠的臨床癥狀及結腸黏膜損傷程度，且兩者聯合應用具有協同效應，作用機制可能與調節Keap1-Nrf2信號通路，啟動機體氧化應激調節程序，提高機體抗氧化能力有關。