開胸順氣丸中檳榔的HPLC含量測定及鑒別方法

于姍姍，齊 紅，李 敏，張秋紅

(濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250102)

開胸順氣丸為傳統中藥制劑，質量標準首次收載于《中國藥典》1963年版一部，歷版《中國藥典》均有收載，現行標準收載于《中國藥典》2020年版一部。開胸順氣丸由檳榔、炒牽牛子、陳皮、木香、姜厚樸、醋三棱、醋莪術、豬牙皂8味中藥組成，具有消積化滯、行氣止痛的功效，臨床常用于氣郁食滯所致的胸脅脹滿、胃脘疼痛、噯氣嘔惡、食少納呆等。《中國藥典》2020年版一部的質量標準為：采用顯微鑒別法對處方中醋莪術、檳榔、炒牽牛子、陳皮、豬牙皂、姜厚樸和醋三棱進行了鑒別，采用薄層色譜鑒別法對處方中檳榔、姜厚樸、炒牽牛子、陳皮、木香進行了鑒別，采用丸劑項下的有關規定對劑型進行了檢查，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對姜厚樸進行了含量測定[1-2]。目前，關于開胸順氣丸的質量標準研究較多[3-5]，但是關于開胸順氣丸中檳榔的含量測定則研究較少。

檳榔具有消積、行氣之功效，占開胸順氣丸處方量的24.5%，為該方的主藥之一。研究表明[6]，若服用不當，檳榔具有口腔毒性、肝毒性、腎毒性、生殖毒性，繼而可引發口腔癌、肝癌等。檳榔的主要活性成分及毒性成分均為生物堿類，含量為0.3%～0.7%，主要包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿，其中又以檳榔堿為主[7]。

《中國藥典》2020年版一部中僅僅用薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)鑒別開胸順氣丸中的檳榔，無檳榔的含量測定方法。本研究建立開胸順氣丸中檳榔堿的HPLC含量測定方法和檳榔的HPLC鑒別方法，為提高開胸順氣丸中檳榔的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀，包括LC-20AT泵、SPD-M20A紫外檢測器、CTO-10AS VP柱溫箱、SIL-20A自動進樣器(日本島津公司)；AE-240電子分析天平、AE-100電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-600GDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

開胸順氣丸(山東新大陸制藥有限公司，批號1908093；山東孔圣堂制藥有限公司，批號1904065；山東華洋制藥有限公司，批號200301X；北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號20083328；仲景宛西制藥股份有限公司，批號191201)；檳榔對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號120915-201813)，氫溴酸檳榔堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111684-202003，按99.8%計)，去甲檳榔堿對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號B26396，按98%計)；乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC含量測定

2.1.1色譜條件

十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.01%磷酸溶液(每1000 ml含2.5 g十二烷基硫酸鈉，32∶68)；檢測波長為215 nm。理論板數按檳榔堿峰計算應不低于3000。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1 對照品溶液的制備 取氫溴酸檳榔堿對照品、去甲檳榔堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含氫溴酸檳榔堿約12 μg、去甲檳榔堿約 2 μg 的混合對照品溶液，即得(檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細，過五號篩，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2.3 陰性對照溶液的制備 按開胸順氣丸處方比例制備不含檳榔的陰性樣品,按“2.1.2.2”項下的方法制備陰性對照溶液。

2.1.3專屬性試驗

在擬定的色譜條件下，分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。色譜圖見圖1。

A：對照品；B：供試品；C：陰性對照圖1 HPLC色譜圖

結果顯示，陰性對照溶液與對照品溶液、供試品溶液在相應位置上無相同保留時間的色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.1.4線性關系考察

取氫溴酸檳榔堿對照品、去甲檳榔堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含氫溴酸檳榔堿116.415 μg、去甲檳榔堿17.68 μg的混合對照品溶液。取5、7、10、15、20 μl分別注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪得標準曲線。結果見表1。

表1 回歸方程、檢出限及定量限結果

去甲檳榔堿在8.84～35.36 ng范圍內線性關系良好，氫溴酸檳榔堿在58.21～232.84 ng范圍內線性關系良好。去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的檢出限及定量限均符合本次試驗準確度和精密度的要求。

2.1.5重復性試驗

稱取同一樣品(批號1908093)各6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測定去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的含量，計算RSD(n=6)。結果：去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的平均含量分別為0.14 mg/g、1.08 mg/g，RSD分別為1.7%(n=6)、1.5%(n=6)。表明該方法重復性良好。

2.1.6穩定性試驗

取“2.1.5”項下第1份供試品溶液適量，分別放置2、4、6、8、10、12 h后進樣測定，計算RSD(n=6)。結果：去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的RSD分別為2.0%(n=6)、1.9%(n=6)。表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.1.7加樣回收試驗

取已知去甲檳榔堿含量(0.14 mg/g)和氫溴酸檳榔堿含量(1.08 mg/g)的開胸順氣丸(批號1908093)各6份，研細，取約0.25 g，精密稱定，加入含去甲檳榔堿1.768 μg/ml、氫溴酸檳榔堿11.642 μg/ml的混合對照品溶液25 ml,再精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，注入液相色譜儀，測定去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的峰面積，計算回收率。結果見表2、表3。

表2 去甲檳榔堿回收率試驗結果

表3 氫溴酸檳榔堿回收率試驗結果

結果：去甲檳榔堿平均回收率為53.3%，RSD為3.1%，準確度不達標，可能原因是去甲檳榔堿的含量低，導致其加樣回收率試驗結果偏低。氫溴酸檳榔堿平均回收率為93.2%，RSD為1.5%，準確度良好。

由此可見，建立的HPLC法適用于開胸順氣丸中檳榔的氫溴酸檳榔堿含量測定。根據《中國藥典》2020年版一部檳榔項下對檳榔堿的規定為：含檳榔堿(C8H13NO2)不得少于0.20%，按飲片中檳榔堿最低含量折算，開胸順氣丸中含量應為0.25 mg/g，再按轉移率為80%計算，暫定為本品每1 g含檳榔以檳榔堿(C8H13NO2)計，應不得少于0.20 mg。

2.1.8樣品含量測定

稱取5批樣品粉末各約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別測定氫溴酸檳榔堿的含量。結果：5批供試品的氫溴酸檳榔堿平均含量為0.26～0.71 mg/g，均符合暫定的限度規定。

2.2 HPLC鑒別

按照《中國藥典》2020年版一部中的方法，對開胸順氣丸中檳榔進行TCL鑒別。結果：斑點顯色不明顯，重現性差。見圖2。

1:檳榔對照藥材;2～6:供試品溶液圖2 TLC鑒別

在建立HPLC法測定檳榔中去甲檳榔堿和氫溴酸檳榔堿的過程中發現，供試品與去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿在相應位置上有相同保留時間的色譜峰，并且陰性對照無干擾，表明建立的HPLC法適用于檳榔中去甲檳榔堿和氫溴酸檳榔堿的HPLC鑒別。

3 討論

3.1 HPLC含量測定

3.1.1測定成分的選擇

楊雅蛟等[8]采用HPLC法同時測定了四磨湯中4種檳榔生物堿的含量，胡璇等[9]采用HPLC法同時測定了檳榔藥材及其不同炮制品中4種生物堿的含量，屈文佳等[10]用HPLC法同時測定檳榔中4種生物堿的含量。筆者通過研究發現，開胸順氣丸中檳榔次堿和去甲檳榔次堿的含量低，在本研究的色譜條件下低于檢出限，故僅對含量較高的去甲檳榔堿和檳榔堿的含量測定方法進行了考察。研究過程中發現，去甲檳榔堿的回收率較低，僅為51.4%～55.3%，低于《中國藥典》2020年版四部“9101分析

方法驗證指導原則”中“回收率限度85%～110%”的規定，故建立的HPLC法僅可用于測定開胸順氣丸中檳榔堿的含量。

3.1.2提取溶劑的選擇

供試品的制備中，首先采用的提取溶劑為50%乙腈-0.5%磷酸溶液(50∶1)50 ml，毒性較大，配制相對繁瑣，研究過程中，改用甲醇為溶劑進行提取，含量差異不明顯，故以甲醇為提取溶劑。

3.1.3色譜系統的選擇

胡璇等[9]在測定檳榔生物堿的過程中，考察了不同類型色譜柱的分離效果，最終選用了陽離子色譜柱。本研究選用了最常用的C18色譜柱及乙腈-磷酸-十二烷基硫酸鈉的流動相進行試驗，發現能得到較好的分離效果及色譜峰形，且較為經濟實用。

3.2 HPLC鑒別

因檳榔的TCL鑒別、提取方法復雜，顯色后只有一個斑點，且斑點顯色不明顯，重現性差。本研究選用HPLC法對開胸順氣丸中的檳榔進行鑒別，重現性好，成分控制更為合理，能同時控制去甲檳榔堿和檳榔堿。

綜上所述，建立的開胸順氣丸中檳榔堿HPLC含量測定方法和檳榔HPLC鑒別方法，能有效控制開胸順氣丸中檳榔的質量，為其安全使用提供更好的質量控制標準。