基于MRM-IDA-EPI技術篩查豬尿中4種β-受體激素殘留

湯逸飛，屠雨晨，陳欣慰，黃 芳，張國平

（嘉興市農業綜合檢驗檢測中心，浙江 嘉興 3140501）

在我國，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林等β受體激素已被禁止使用[1]。當高劑量使用這類β受體激素時，雖然隱形添加可顯著提高豬或其他家畜體質量以及酮體瘦肉率，但其殘留物很容易通過食物鏈進入人體進而危害健康[2]。本研究以豬尿為例，結合快速前處理和超高效液相分離（QuEChERS-UPLC）方法，首次檢測端采用多反應監測-信息依賴-增強型質譜掃描（MRM-IDA-EPI）技術靶向同步對4種β受體激素的離子對和碎片離子信息進行識別和分析，降低了豬尿的基質效應對低含量化合物檢出的影響，可快速準確地完成對化合物的識別[3]，為豬肉產品質量安全監管和溯源提供有力的技術支撐[4]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器包括液相串聯質譜儀（LC-20AD/QTRAP4500，日本島津公司/美國AB Sciex公司）、ROTINA 420R離心機（德國Hettich公司）和XW-80A旋渦混合器（上海精密科學儀器有限公司）；提取鹽試劑包成分為4.0 g硫酸鎂，1.0 g氯化鎂，1.0 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉；凈化離心管成分為150 mg N-丙基乙二胺（PSA），15 mg石墨化炭黑（GCB），885 mg硫酸鎂。克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林均為有證標準物質；乙腈和甲醇均為色譜級；實驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

QuEChERS-UPLC條件:量取豬尿10.0 mL，加入10 mL乙腈溶液，加入提取鹽試劑包，加入1枚陶瓷均質子，振搖1 min，4 200 rpm，離心5 min。取上清提取液6.0 mL，轉移到凈化離心管中，渦旋1 min，4 200 rpm，離心5 min。取上清凈化液2 mL，氮吹至近干，初始流動相（A:B=95:5）溶液復溶至1.0 mL，0.22μm水膜過濾待測液。色譜柱采用Kinetex Biphenyl柱（2.6μm，2.1 mm×100 mm），流動相A為A（0.2%甲酸+2 mmol/L乙酸銨水溶液），B為甲醇，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，進待測液1μL。流動相梯度條件為0.1～1.0 min，A:B=95:5；1～4 min，A:B=95:5→40:60；4～8 min，A:B=40:60→36:64；A:B=5:95保持5 min洗柱；A:B=95:5保持5 min平衡。

MRM-IDA-EPI條件:在MRM模式下，正離子電噴霧離子源（ESI+）設定源參數為噴霧電壓（Ion－Spray Voltage）5500 V，輔助氣1（GS1）55 Arb，輔助氣2（GS2）55 Arb，輔助氣加熱溫度（TEM）550℃，氣簾氣（CUR）35 Arb，碰撞氣（CAD）Medium；β-受體激素監測離子對（MRM）解簇電壓（DP），碰撞能量（CE）見表1。在相應IDA-EPI模式下，對在離子對響應值超過500 cps的進行EPI質譜掃描，EPI掃描范圍m/z50～600，碰撞氣（CAD）Low，掃描速率10000Da/s，解簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）10 eV，其他參數與MRM模式設定一致。

表1 4種β-受體激素在甲醇溶劑中的質量分析參數

2 結果與分析

2.1 空白豬尿基質對數據分析的影響

為充分體現豬尿檢測中可能存在的假陽性，對提取離子流色譜圖（XIC）進行篩查。XIC結果表明，空白豬尿基質對提取-凈化試劑包組合不會產生假陽性。根據在豬尿加標基質中峰形良好，沒有雜峰干擾并且響應較大的離子對為定量離子對。豬尿基質中4種β-受體激素相應離子對的離子流（TIC）如圖1所示，其中圖中編號為表1中對應的4種β-受體激素。

圖1 豬尿基質中4種β-受體激素的總離子流

2.2 結構解析

在正離子模式下，對4種β-受體激素離子對進行+MRM-IDA-EPI分析，4種β-受體激素可被準確識別，見圖2。該圖中的化合物編號與豬尿中鑒定的相關信息與化合物的編號相一致，見表2。4種β-受體激素碎片離子雖然受到豬尿基質影響會出現一些不相關信號，但與文獻[5]比較，質譜裂解規律呈現的[M+H]+等特征碎片離子均已識別。

表2 豬尿中MRM-IDA-EPI鑒定的4種β-受體激素相關信息

圖2 豬尿中4種β-受體激素定量離子對所對應的XIC圖和EPI圖

2.3 標準曲線的建立

以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，將配制的0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L和50μg/L系列質量濃度繪制標準曲線。4種β-受體激素線性回歸方程、相關系數（r）、檢出限（LOD，信噪比S/N≥3）和定量限（LOQ，信噪比S/N≥10）見表3。結果表明，4種β-受體激素在豬尿中0.5～50μg/L的線性范圍良好，相關系數r在0.985～0.994之間，檢出限在0.07～0.13 ng/mL之間，定量限在0.24～0.44 ng/mL之間。

表3 4種β-受體激素在豬尿中的線性回歸方程和相關系數

2.4 回收率試驗

采用標準曲線法對加標量分別為0.5 ng/mL，5 ng/mL和50 ng/mL的豬尿空白基質樣品進行加標回收試驗。低質量濃度（0.5 ng/mL）p%范圍為74.12%～112.80%，RSD%為1.75%～14.38%；中質量濃度（5ng/mL）p%范圍為73.67%～109.33%，RSD%為0.63%～6.70%；高質量濃度（50 ng/mL）p%范圍為62.11%～108.45%，RSD%為0.95%～14.35%。結果表明，該檢測方法準確度較好。

表4 4種β-受體激素在豬尿基質中的回收率和相對標準偏差(n=3)

3 討論和小結

豬尿中定量檢測β-受體激素殘留是比較常規的檢測項目，以往檢測僅通過出峰的保留時間（RT）判定陽性，往往容易發生假陽性的情況。本研究建立的方法主要特點是以QuEChERS-UPLC技術為基礎，在+MRM-IDA-EPI模式下，既相對滿足基質外標法定量的靈敏度、準確度和精密度的要求，又可同步通過EPI結構解析，復核4種β-受體激素[M+H]+等特征碎片離子的檢出。該方法可用于豬尿中4種β-受體激素的快速篩查測定，具備農業農村部公告第197號-10-2019相似樣品制備和檢測靈敏度的特點。