肺癌重癥呼吸衰竭ALK抑制劑耐藥的基因檢測分析

張睿 張郭亮 王飛娟

(銅川市人民醫院，陜西 銅川 727000)

肺癌是發病率和死亡率增長最快，對患者健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，預后極差，其中晚期非小細胞肺癌占所有肺癌的80%[1]。有研究[2]表明，從分子水平研究，非小細胞肺癌的發生機制與其驅動基因突變相關。原癌基因1蛋白酪氨酸激酶ROS(ROS1)是一個單體型受體酪氨酸激酶，可融合形成非小細胞肺癌的致癌性驅動基因。針對ROS1融合基因陽性的靶向藥物(ALK抑制劑)，如克唑替尼在改善患者生存質量，延長生命周期方面有良好療效，但最終所有患者都會出現耐藥[3]。因此探討ALK抑制劑發生耐藥的機制，是指導非小細胞肺癌進一步治療的關鍵。本文分析14例ALK抑制劑治療后繼發耐藥的非小細胞肺癌重癥呼吸衰竭患者的基因情況，探討其與耐藥機制的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2018年10月我院腫瘤科收治的接受克唑替尼治療后出現繼發性耐藥的非小細胞肺癌重癥呼吸衰竭患者14例。其中男4例，女10例；平均(65±8.7)歲；吸煙4例，不吸煙10例；TNM分期：Ⅰ～Ⅲa期1例，Ⅲb～Ⅳ期13例；病理分型：腺癌12例，非腺癌2例；EGFR基因狀態：野生型13例，未知型1例；送檢樣本類型：穿刺組織切片4例，外周血7例，胸水3例。納入及排除標準：均經臨床病理確診為非小細胞肺癌，且年齡≥18歲；經RT-PCR、NGS或 FISH技術檢測提示ROS1基因陽性；均接受克唑替尼口服治療，且治療時間超過4周；出現疾病進展，即出現新病灶或基線病灶徑總和增加20%左右[4]；神志清楚，無言語功能及認知功能障礙；無系統性免疫性疾病、嚴重感染或其他潛在嚴重性疾病；臨床資料完整，無失訪情況；患者及其監護人均簽署知情同意書，同意參加本次研究。

1.2方法 所有送檢樣本均采用NGS技術進行檢測。血漿樣本檢測：抽取患者10 mL外周血置于EDTAD抗凝管中，輕柔顛倒6～8次充分混勻，在4～6 h內于4℃下對樣本進行離心，1 600 g 10 min；將離心后的上清血漿分別置于1.5 mL或2 mL離心管中，離心1 600 g 10 min，去除殘余細胞，將離心完的上清血漿置于新的1.5 mL或2 mL離心管中，將其與剩余血細胞同置于-80℃冰箱冷凍保存；按照Qiagen提取試劑說明書對分離血漿(2～3 mL)進行血漿ctDNA提取；依據QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑說明書對血細胞樣本進行基因組DNA提取，并采用Qubit對其進行定量處理。胸水樣本檢測：將提取到的胸水樣本10～15 mL保存于2管10 mL無菌管中，并將其置于-20℃或-80℃冰箱中冷凍保存；按照QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑說明書對胸水樣本進行基因組DNA提取，并采用Qubit對進行定量處理。測序方法：制備測序文庫，按照建庫試劑盒推薦步驟建立行ctDNA和基因組DNA文庫；上機測序，按照操作說明書進行上機測序；分析測序數據的生物信息，使用比對軟件BWA對測序序列進行比對，MuTect進行SNP變異分析，GATK進行InDel變異分析，contra.py進行拷貝數變異分析。

1.3觀察指標 基因改變情況(基因數目、類型、改變位點)；有效性指標(血氣指標、呼吸頻率、心率)；安全性指標(住院時間、并發癥)。

2 結 果

2.1腦轉移情況 8例患者以腦轉移為主要進展部位，約占57.1%，6例腦轉移患者在出現腦部病灶進展時肺部情況穩定且有所改善，約占75.0%，且6例患者仍存活，占75%。

2.2基因改變情況 3例患者出現1個基因改變，4例患者出現2個基因改變，2例患者出現3個基因改變，2例患者4個基因改變，1例患者出現5個基因改變，2例患者出現6個基因改變，共出現剪切位點(2%)，讀框內插入缺失(3%)，基因多樣性改變(3%)，基因截斷改變(3%)，移碼突變改變(5%)，基因拷貝數變改變異占(6%)，基因融合改變(25%)，錯義突變改變(53%)，8類基因突變類型見圖3。

圖1 基因改變類型

2.3ROS1獲得性突變陽性及突變陰性的基因改變情況 14例耐藥的非小細胞肺癌患者共發現51個基因改變，平均每個患者約出現3.6個基因改變。其中13例患者出現ROS1基因融合改變，約占比92.9%；2例患者出現CDKN2A基因突變，約占14.3%；4例患者出現G2032R點基因突變，約占28.6%；2例患者出現TP53點突變，約占14.3%，均存在于獲得性ROS1基因突變陽性患者中；3例患者出現TP53點突變，約占21.4%，均存在于獲得性ROS1基因突變陰性患者中，還在此類患者中發現TERT、NEF2L2、PTPRD、OR5L2等罕見基因及K-RAS、EGFR、KIT、BRAF、PIK3CA等常見基因突變。

3 討 論

手術治療、化療及放療在改善晚期非小細胞肺癌的生存率方面無顯著作用，且存在較多嚴重并發癥[5]。因此應用新型的高效的抗癌藥物則尤為重要。

近年來，多種病理類型的肺癌中都可見到驅動基因的改變，但兩種以上驅動基因突變在同種類型的肺癌中少見[6]。針對基因突變的靶向藥物治療具有療效好，生存率明顯提高，預后改善及并發癥少的優點，但存在耐藥率極高的局限性[7]。EGFR是肺癌中最常見的致癌驅動基因，而ALK是一種跨膜受體酪氨酸激酶，可激活多個細胞通路，是非小細胞肺癌的新型致癌驅動基因，是目前臨床常見的治療靶點[8]。膠質母細胞瘤中發現的ROS1融合基因屬于胰島素受體家族，也被證實為新的肺癌治療靶點，在0.9%～2.0%的非小細胞肺癌患者中可檢測該基因[9]，其基因陽性患者多為年齡偏小，但其與EGFR及ALK融合基因等突變并不能共存于肺癌患者體內，在EFGR和ALK融合基因陰性的非小細胞肺癌患者中ROS1基因的檢測率明顯提高[10]。

本文研究采用NGS檢測技術對患者的血液樣本、胸水樣本及組織切片樣本進行檢測，具有高度敏感性和特異性。綜上所述，筆者認為，ROS1融合基因陽性的非小細胞肺癌重癥呼吸衰竭患者耐藥發生機制相對復雜，可能與多種基因突變相關，可以采用NGS檢測技術測定耐藥基因，以指導臨床用藥，但由于本文樣本量較少，且采用的血液樣本是否只代表影響疾病進展的最主要DNA基因突變仍存疑，需要進一步深入研究。