新生兒甲基丙二酸血癥的篩查與基因突變分析

夏飛燕 尹文東 韋洪偉 孫永葉

甲基丙二酸血癥（methylmalonic acidemia，MMA）作為一種有機酸血癥，可導致神經、消化以及泌尿等多系統損傷，大多伴有染色體隱性遺傳，若救治不及時很容易導致患者死亡或殘疾[1]。MMA發病原因復雜，甲基丙二酰輔酶A變位酶（methylmalonyl—CoA mutase，MCM）或其輔酶鈷銨素代謝缺陷是其主要發病機制。MMA臨床表現多樣，在任何年齡段均可發病，且臨床癥狀無特異性，很容易被誤診或漏診，通常根據生化或基因等檢查對其進行確診[2]。串聯質譜技術，可對氨基酸代謝病等多種遺傳代謝病進行篩查，能夠一次篩查多種疾病，將其應用于MMA的篩查，能夠有效提高臨床對MMA患兒的診斷效果[3]。本研究旨在探討液相色譜串聯質譜篩查MMA的效果和MMA患兒基因突變情況，以便為臨床診治MMA提供重要依據，具體情況如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2014年8月—2019年12月期間，臨沂市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心的150 583例新生兒為本次研究對象，其中男性82 675例，女性67 908例，均為活產新生兒，均接受遺傳代謝病篩查，新生兒家屬均知曉本研究并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 串聯質譜技術 （1）液相色譜檢驗：采集新生兒出生3~7天后的足底血，將其滴注到采血透紙上，制成干血濾紙片后，送至新生兒疾病篩查中心對其進行檢驗。使用美國Waters公司生產的Xevo TQD型液相色譜串聯質譜儀，對樣本中的氨基酸、酰基肉堿等情況進行分析。其中血游離肉堿的參考范圍為10~50μmol/L，乙酰肉堿（C2）參考值為8~40，乙酰肉堿（C2），丙酰肉堿（C3）參考值為0.2~4.3μmol/L，C3/C2比值的正常范圍為0.03~0.20。（2）氣相色譜檢驗：對于篩查出的MMA患兒，均采集尿液，經甲基硅烷化衍生等多種處理后，使用日本島津公司公司生產的QP2010型氣相色譜質譜儀，采用半定量法對其進行檢驗，尿液中甲基丙二酸的正常參考范圍為0.2~3.6，甲基枸櫞酸正常范圍為0~1.0。

1.2.2 基因突變分析 采集MMA患兒2 mL外后靜脈血，將其置于抗凝管內，使用Blood DNA mini kit進行基因組DNA提取，測定其濃度后保存在-20℃條件下備用，采用常規Sanger測序技術對其陽性突變位點進行驗證，并檢測患兒父母的基因組DNA相應陽性位點。

1.2.3 臨床診斷及分型 對于初篩陽性者將其召回復查，若復查結果仍顯示為陽性，則對其進行尿氣相色譜質譜檢驗，并對其進行實驗室檢查、基因突變等檢查，以進一步明確患兒病情。診斷依據：（1）伴有嗜睡、喂養困難、生長發育落后、抽搐、肌張力低下和肝腎功能等生化檢查異常；（2）液相色譜檢測顯示血C3、C3/C2升高，游離肉堿水平降低；（3）氣相色譜檢測顯示尿甲基丙二酸/甲基枸櫞酸水平升高；（4）排除營養因素所引發的繼發性MMA。分型：根據其同型半胱氨酸水平（homocystine，Hcy）分為單純型MMA（Hcy正常）和合并型MMA（Hcy升高）。根據發病年齡劃分，將發病年齡在1歲及以下劃分為早發型，發病年齡大于1歲為晚發型。根據維生素B12負荷試驗分為維生素B12有效型和無效型。

1.2.4 臨床治療及隨訪 急性期以糾正酸中毒、補液為主，靜脈滴注左旋肉堿，使用劑量為100 mg/（kg·d）；肌內注射維生素B12，1mg/d，連續治療5天。高氨血癥患兒可口服25 mg/（kg·d）的精氨酸。維持期維生素B12有效患兒，肌內注射維生素B12，1 mg/次，每周3次；口服左旋肉堿50 mg/（kg·d）；亞葉酸鈣，15 mg/（kg·d）；甜菜堿，200 mg/（kg·d）。維生素B12無效患兒以飲食控制為主，控制總蛋白攝入量為2~4 g/（kg·d），適當補充礦物質、維生素等。隨訪6個月觀察患兒病情控制情況，使用Gesell嬰幼兒發育量表評估患兒智能發育情況，以各能區評分在75分以上為智能發育正常，否則為異常。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 MMA檢出及生化檢驗情況

本研究篩查的150 583例新生兒中，診斷為MMA的患兒共18例，其中男性患兒10例，女性患兒8例，患兒確診時日齡為18~47天，平均（30.45±4.82）天。根據Hcy水平分類為單純型MMA 5例，均為維生素B12無效型，另外13例為合并型MMA，均為維生素B12有效型，且均接受正規治療，患兒治療后各生化指標與治療前比較均明顯改善（P＜0.05）。詳見下表1。

表1 合并型MMA患兒治療前后生化檢測結果（±s）

表1 合并型MMA患兒治療前后生化檢測結果（±s）

時間 血C3（μmol/L） 血C3/C2Hcy（μmol/L） 尿甲基丙二酸 尿甲基枸櫞酸治療前7.01±1.860.82±0.3598.46±35.7968.72±15.436.98±2.45治療后3.42±1.250.19±0.0532.58±14.265.65±2.381.01±0.57 t值5.7766.4256.16614.5658.557 P值0.0000.0000.0000.0000.000

2.2 MMA患兒基因突變分析

本研究診斷出的18例MMA患兒中，有11例采用高通量測序實時基因突變檢測，其中2例為單純型MMA，9例為合并型MMA。其中8例檢測出MMACHC基因突變，1例檢測出HCFC1基因突變，還有1例檢測出MMACHC和1例HCFC1基因突變，共檢測出11種基因突變位點，其中未見報道位點3種（C.4439C＞T、C.4537A＞T、C.239A＞G），已報道位點8種（C.666C＞A、 C.440_441del、C.482G＞A、C.80A＞G、C.599G＞A、C.394C＞T、C.656_658delAGA、C.609G＞A），其中C.609G＞A為最為常見的基因突變位點。見表2。

表2 MMA患兒的基因突變檢測結果分析

2.3 隨訪及預后情況

隨訪6個月，3例單純型MMA患兒中2例患兒的體格、智能均發育正常，尿甲基丙二酸、甲基枸櫞酸均明顯下降，但仍未達到正常水平。另外1例隨訪過程中發現生長發育遲緩，輔以康復訓練后各血C3、C3/C2以及尿甲基丙二酸等指標均下降，但仍高于正常范圍，3月齡時Gesell嬰幼兒發育量表各能區評分為語言61分，適應性66分，精細動作65分，大動作和個人-社交分別為61分和69分。5月齡時突然發病就診，家屬考慮患兒預后差放棄治療，6例患兒在隨訪過程中5例生長發育正常，血C3、C3/C2、Hcy、尿甲基丙二酸、甲基枸櫞酸等指標均控制良好；1例出現輕度精神運動發育遲緩，血C3、C3/C2等指標均較治療前下降，但仍高于正常水平。

3 討論

MMA是一種先天性有機酸血癥，可導致多臟器損傷，在新生兒和成人中均可發病[4-6]。我國MMA發病率尚不明確，本研究通過對150 583例新生兒的MMA篩查情況進行分析發現，確診為MMA患兒18例，發病率為1:8 366。確診的18例MMA患兒中，有11例接受了高通量測序實時基因突變檢測，共檢測出了11種基因突變位點，其中未見報道位點3種，已報道位點8種，在這些基因突變位點中以C.609G＞A為最為常見。隨著人們對MMACHC認識的深入，越來越多的研究發現，MMACHC基因型與MMA患兒臨床表型以及預后具有較大關系[7]。有研究報道，C.609G＞A這一熱點突變患兒大多發病較早，且病情重，預后差，該突變可導致色氨酸翻譯提前終止，從而導致cblC蛋白功能缺陷[8]。C.656_658delAGA突變也同樣會導致上述問題發生。C.482G＞A突變對蛋白功能的影響相對較小，所以臨床表型較輕，通常與晚發型MMA有關[9-11]。C.80A＞G突變可導致氨基酸向精氨酸轉變，是導致患兒心血管系統受累的主要原因。C.394C＞T突變可產生截短蛋白，導致患兒精神不佳或喂養困難。C.599G＞A可提前終止肽鏈合成[12]。

總之，在新生兒期應用液相色譜串聯質譜技術進行MMA篩查，并結合基因測序分析其基因突變情況，有助于早期發現和干預MMA，從而改善患兒預后。