病理檢驗過程中石蠟切片及HE染色常見問題及對策分析

梁津杰

石蠟切片與HE染色是病理檢驗切片處理的主要技術手段，其處理效果對于臨床診斷有著直接的影響，質量上乘的切片才是實現正確診斷的根本要求，尤其是在臨床諸多重大疑難病理的診斷上，必須保障高質量的處理切片，才能獲取準確診斷結果，成為臨床診療的可靠依據。但在臨床實踐中切片處理質量差等問題始終無法避免，因此，本次分析意在總結病理檢驗中石蠟切片與HE染色的常見問題，并根據每個問題出現的原因探究針對性解決對策，以便提高石蠟切片與HE染色質量。具體來講，本次選擇我院2018年10月—2019年10月由筆者質控的約4 200張病理切片作為研究對象，詳細分析其切片處理以及HE染色上存在問題及具體表現，并基于問題出現原因給出解決對策，以供參考與借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次選擇我院2018年10月—2019年10月由筆者質控的約4 200張病理切片作為研究對象。

1.2 石蠟切片及HE染色常見問題及原因

1.2.1 石蠟切片的常見問題及原因 （1）皺褶及折疊，切片內部或者邊緣出現組織重疊。該問題產生的原因有切片問題也有漂片問題，切片時如組織較硬，有鈣化灶或者異物存在，切片刀不夠鋒利，均容易形成皺褶，蠟塊冷卻不足、較軟也容易出現皺褶，漂片時水溫過低，組織切片在溫水中不能完全展開，也會形成皺褶。 （2）切片散開，漂片過溫水的時候，切片向四周擴大，甚至整張切片破裂。該問題一般由于溫水水溫過高導致，或者由于組織脂肪較多，脫水不好，脂肪在溫水中更容易散開。 （3）刀痕，該問題產生一般由于組織內含有較硬的成分，如果結石殘渣，鈣化點，肺粉塵沉積等，或者石蠟中有雜質，使切片刀形成缺口，導致鏡下組織出現組織缺損的細小筆直紋路。 （4）切片不完整，需要診斷的病灶區域沒有切出或切面不完整，會導致診斷困難或者漏診。該問的題產生有以下幾點，取材醫生取材時，組織切面不平整，技術員包埋時組織沒有按平，如一個包埋盒里有多個組織的，這一步顯得尤為重要，切片時組織蠟塊沒有修到最大切面，這些方面都會導致切片不完整。 （5）篩孔與劃痕，鏡下出現很多大小不等的組織空洞，其內不見細胞結構，邊緣不整齊。該問題是由于粗修蠟塊的時候，修片進刀幅度過大，動作過快，使組織切面粗糙不平，或者出現切面多處發白，從而造成切片出現大小不一的空洞。 （6）切片厚薄不均或跳片，切片上出現肉眼可見的平行的厚薄不等區域或HE染色后出現明顯的平行分布的深染或者淺染區。該問題產生的原因有以下幾點，切片機刀架卡位沒卡緊；刀架變形，導致刀片夾不緊；蠟塊包埋盒表面有多余石蠟，切片機蠟塊夾頭里有碎蠟，使蠟塊沒有夾緊；包埋時加蠟不足或過程中石蠟漏出，使包埋盒與組織相連不夠緊密，或者形成空心蠟塊；組織本身較硬及切片過快。 （7）顫痕，鏡下出現比較密集的平行的裂紋，主要出現在胃腸道黏膜腺體、子宮內膜、淋巴結。該問題出現主要因為蠟塊切片溫度過低，組織發脆導致，切片速度過快，有時也會引起。 （8）組織發白，不能切出完整切片，該問題出現主要因為組織脫水不良，脫水良好的組織肉眼應該呈半透明狀，如部分呈白色，甚至有水分滲出，說明組織脫水不良，沒有石蠟浸入，缺少石蠟的支撐，難以切片。 （9）蠟塊的水反滲，某些蠟塊在較多水的冰盤上放置久了，會出現組織切面向外膨脹，發白，導致不能切片，該問題出現是由于組織脫水不足導致水反滲。 （10）秋冬季靜電大，難以切片，由于秋冬季濕度很低，容易產生靜電，靜電會使切片難度大增，切片會相互粘附、鄒縮成團，不能展開成片。 （11）蠟塊內部組織周邊出現或多或少的裂紋，主要因為某些石蠟質量問題，或者冷卻過快，或者在石蠟沒完全冷卻的情況下強行把包埋模撬離，都會使蠟塊內部形成裂痕。

1.2.2 HE染色常見問題及原因 （1）蘇木精染色過淡，導致細胞核染色出現暗淡、蒼白表現。該問題主要由使用蘇木精染液中切片停留時間過短造成；分化時間過長；或蘇木精存在過度氧化問題，導致染色能力受到影響，不符合使用標準[1]。 （2）細胞核有紅色或棕色改變情況。該問題主要因蘇木精染液有過度氧化情況出現，或在使用蘇木精染色過程中切片返藍不足，或是伊紅染色問題導致細胞核被伊紅覆蓋。 （3）伊紅著色過淡，該情況主要因伊紅溶液pH值超過標準要求，也可因切片過薄，染色過程中藍化液殘留過度，或因在乙醇脫水環節停留過長時間。 （4）顯微鏡觀察中切片有水珠，或肉眼觀察有霧氣，這種情況主要是切片在乙醇處理后未充分進行脫水，導致封固后水分無法排出。 （5）脫蠟后發現切片有白色斑點，該情況出現的主要原因是烤片環節溫度過低，烤片時間不足，切片未充分烤干；或二甲苯在切片停留時間過短；或二甲苯使用過久，導致脫蠟不完全[2]。 （6）蘇木精染色過深，擠占細胞質位置。該類問題主要受三種情況影響，蘇木精使用過程中分步驟處理時間過短；或切片太厚；或切片在蘇木精染色環節停留時間過長；或蘇木精pH值過高，細胞質共染。 （7）切片上有藍黑沉淀物質出現，蘇木精染色環節出現金屬膜，附著在切片上。 （8）細胞質過染情況，由于染色過程中伊紅溶液濃度過高；伊紅染色后對切片進行乙醇脫水處理時間較短；伊紅染色時間過長[3]。 （9）切片位于光鏡時聚焦困難，封固過程中封固劑殘留在蓋玻片上。 （10）HE染色不均勻，有斑點或大面積不均勻存在，散布在切片周圍，影響細胞核染色質的均勻分布。 （11）切片中出現裸核改變，這是一種有色素樣點狀晶體存在或黑色光滑細胞核存在情況，主要是因切片在封片前較長時間處于空氣當中，導致二甲苯發揮干凈，切片過于干燥[4]。 （12）細胞核呈灰藍狀態，由于染色過程中組織溫度過高；或固定時間不充分；或石蠟過長時間的停留；或未充足固定后立即進行乙醇脫水處理[5]。

2 討論

本次研究中統計了石蠟切片及HE染色中常見的23種問題，其中每種類型出現的頻率不一致，但這23種問題對于臨床診斷都有著直接的影響。而且在現有研究中也充分證明石蠟切片處理以及HE染色中切實有問題存在，尤其是染色環節，染色過深、過淡、不均勻情況頻繁出現，嚴重影響最終染色質量，并干擾臨床醫生對病理的判斷。本次研究中，對于每種問題的解決策略如下。

2.1 石蠟切片問題

（1）出現皺褶及折疊，如是組織問題，如鈣化灶，有時難以避免，如是刀片問題，則更換新刀位，如是漂片水溫問題，則調節水溫到適合溫度，漂片時間適當，使切片能完全展開，漂片溫度一般比石蠟熔點低10℃左右，但具體溫度要根據自己科室作出微調。 （2）如切片散開，應該及時調節漂片機水溫，使水溫能夠讓組織展平，又不至于擴大或破裂，如是含脂肪組織較多，可以縮短漂片時間，或者不漂溫水，以保證組織的完整性。 （3）出現較多刀痕時，應該更換新刀位，但對于某些組織，如鈣化組織、肺淋巴結組織，難以不出現刀痕，建議在不影響診斷的情況下，可以酌情忽略。 （4）出現切片不完整，必須規范取材、包埋、修片這幾個環節的操作，醫生取材盡量使組織塊切面平整，包埋時把標本按平，含有多塊組織的，每塊組織均要按平，粗修時要觀察蠟塊是否已經暴露出最大切面，必要時要對蠟塊進行重新包埋。 （5）出現篩孔與劃痕，在修片的過程中應把握好進刀的幅度，一般在粗修模式下，設置厚度為5~10 μm，在修片的最后再細修3~5刀，使蠟塊切面光滑，盡量少出現毛糙及白點。 （6）出現切片厚薄不均或跳片，檢查儀器的卡位是否卡緊，如果是儀器問題，如刀架變形、卡位不緊，應及時維修，包埋不牢固或者空心的蠟塊應從新包埋，遇到較硬組織時，可以更換新刀位，稍微降低切片輪轉速度，或者讓蠟塊稍微復溫再切片，對跳片有比較好的改善，平時要注意保養切片機，以免碎蠟碎屑藏積使儀器卡位不緊。 （7）出現顫痕，可以用剛開始融化的冰盤作為蠟塊的冷卻臺，此時溫度接近0℃，再降低切片速度，能明顯減少顫痕出現的幾率，如用制冷臺，應調節溫度到0℃，但筆者建議用自己制作的冰盤冷卻，效果更好。 （8）出現組織發白，應該從組織固定、脫水方面進行探討，新鮮組織必須在離體后半小時內切開固定，固定時間足夠，小標本固定時間大于8小時，大標切開本固定時間大于16小時，取材標本體積不能超過2 cm×1.5 cm×0.3 cm，脫水程序要摸索出適合自己科室的條件。 （9）蠟塊的水反滲，蠟塊不能在水較多的冰面上過長時間，可以在切片前3~5分鐘再放到冰面進行冷卻，基本可以避免該情況發生。 （10）秋冬季靜電大，難以切片，此時可以增加室內濕度，購買專用的切片加濕器，或者改裝家用加濕器，加裝管道，引管到蠟塊夾頭旁，調節霧氣的大小，使蠟塊輕微濕潤，即可除去靜電影響，或者在冰面加水，使冰面濕潤，也可減少靜電影響，但切片時注意不能修片太多，一般前3~5張切片效果好，往后的切片會逐漸出現皺縮成團的現象。 （11）蠟塊內部組織周邊出現裂紋，如是石蠟質量問題，應該更換批次或者更換牌子，剛包埋好的蠟塊，石蠟仍是液態，應平放在冷卻臺上自然冷卻，不應快速置于冰水當中，待完全凝固后再分離包埋模，可明顯減少裂紋出現。

2.2 HE染色問題

（1）現蘇木精染色過淡問題，應重新進行切片染色，延長蘇木素浸泡時間，縮短分化時間，也可在染蘇木素前把片浸泡在1.5%醋酸溶液中，調節切片的pH值，使蘇木素對細胞核染色的針對性增強，同時可以降低細胞質的共染，其中1.5%冰醋酸也可以作為蘇木素中冰醋酸的補充，可穩定蘇木素的pH值，延長蘇木素的使用壽命。 （2）出現細胞核有紅色或棕色改變時，需要在染色前檢查蘇木精的質量情況，如果存在過度氧化以及變質等問題，及時進行更換，染色過程中必須經過返藍液浸泡，保障藍化時間充足。 （3）對于伊紅著色過淡問題，染色前測試伊紅溶液的pH值，伊紅溶液pH值必須低于5，盡量控制在4.6~5.0之間，以便保障染色效果。但水溶性伊紅pH值容易受外界影響，如醋酸的揮發，殘余自來水的混入等，均會使伊紅的pH升高，影響著色效果，可以更換為0.2%的醋酸化伊紅醇溶液[6]，在染伊紅前先浸泡95%乙醇，同時，需要切片充分藍化后，徹底清潔其中的弱堿性溶液后再進行下一步操作；測量切片厚度是否太薄，避免乙醇脫水時間過長稀釋其中顏色[7]。 （4）對于顯微鏡下觀察切片有水珠情況，發現后將蓋玻片拿掉，溶解封固劑，可在無水乙醇前添加一缸苯酚+TO/二甲苯溶液，取出殘余水份，并連續將切片放置在新鮮無水乙醇中，脫水完成后進行再次封固。 （5）對于切片脫蠟后出現白色斑點問題，必須保障充分烘烤，除去切片中的水分；對于烘烤時間過長問題，切片可能出現脫落，后續處理無法補救；二甲苯脫蠟時間要充足，如出現脫蠟不完全，可以延長時間或加溫，還需要定期更換脫蠟二甲苯，一般500 mL二甲苯處理500以內張切片為宜，此外，如果因二甲苯時間過長短導致斑點，可通過脫色、漂白重新進行脫蠟染色[8]。 （6）對于蘇木精染色過深問題，如果因切片過厚導致，可重新進行切片；但并非切片過厚造成，則需要重新進行染色，縮短蘇木素染色或者延長分化時間。 （7）對于切片上有藍黑沉淀物質問題，需要在每次染色前認真檢查與過濾蘇木精，盡量使用處于半氧化狀態的蘇木精，避免產生金屬膜。 （8）對于細胞質出現分化不足或過染問題，可通過縮短伊紅染色時間，或者延長伊紅后脫色乙醇的時間；若因切片過厚，則需要調整切片厚度[9]。 （9）對于切片位于光鏡時聚焦困難問題，需要移出蓋玻片，使用新的蓋玻片進行重新密封，并嚴格檢查切片密封效果，如果為密封方法問題，需要及時進行調整。 （10）對于HE染色不均勻問題，細胞核染色不均多為固定不足引起，如外層細胞核染色正常，內層細胞核染色偏淺或灰染，應規范組織固定流程，使組織固定充分，細胞質染色不均，多數由于伊紅分化時沒有充分抖動，造成脫色不均引起，改成醇溶性伊紅的染色程序，能有效的減少細胞漿染色不均的情況[10]。 （11）對于切片中出現裸核改變問題，先拿掉蓋玻片，溶解封固劑，重新進入到脫水環節、封固環節，使切片處于濕潤狀態，避免其過于干燥問題[11]。 （12）對于細胞核呈灰藍狀態問題，從理論層面來講，這種情況主要是因組織與石蠟沒有充分接觸，或在溫度較高蠟液中停留較長時間，其中對于第一種情況，需要將組織用塑料包埋盒包裝放置在冷空氣內進行冷凝，冷凝后重新加熱，融化石蠟；而第二種情況需要在組織固定良好情況下，重新進行脫水處理[12]。

綜上所述，石蠟切片與HE染色作為臨床病理檢驗不可缺少的技術手段之一，對于病理檢測結果質量的影響關系到臨床診斷的科學性以及準確性，因此，面對當前石蠟切片處理以及HE染色問題頻出的情況，本文對常見的問題進行了系統的總結，并針對每種問題出現的原因進行了解決對策分析，希望該問題能夠引起醫院以及臨床的重視，在臨床實踐當中不斷補充，總結豐富經驗，科學應對石蠟切片處理以及HE染色中出現的突發情況，從而有效提升病理檢驗準確性[13]。