T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF檢測技術在AIDS/TB人群中的診斷價值

姚正鋼 陳勇毅 藍夢穎

結核感染是艾滋病常見的機會性感染，結核病與艾滋病相互促進病變進展、惡化、加速導致患者死亡，HIV陽性患者感染結核菌后，結核病發病率較HIV陰性者高30倍，結核病已成為艾滋病毒感染者/艾滋患者中的一個主要死因[1]，早期診斷并進行及時有效的治療對艾滋病合并結核病的預后至關重要[2]。艾滋病合并繼發性肺結核（AIDS/TB）患者肺結核的臨床表現不典型、肺部影像學不特異、痰涂片找抗酸桿菌陽性率低，在基層醫院易漏診、誤診，特別是早期診斷較為困難[3]。結核感染T細胞檢測（tuberculosis T cell spot detection, T-SPOT.TB）及Gene Xpert MTB /RIF近年在臨床得到推廣，對提高肺結核診斷的準確性有較大的幫助[4-5]，由于這兩種方法在艾滋病合并繼發性肺結核研究較少，本研究通過對本院就診患者的資料進行分析，探討T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB /RIF在艾滋病合并繼發性肺結核人群的診斷價值，以期為臨床提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2019年1 月—2020年9 月在我院就診的疑似肺結核患者323例的資料進行分析，所有納入病例均進行T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB /RIF、痰涂片找抗酸桿菌、痰結核菌培養、抗HIV、CD4+淋巴細胞檢查。所有入組患者均已獲取知情同意，且簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。根據臨床癥狀、實驗室檢查、影像學檢查、病理學結果，按照診斷標準，將符合入組條件的病例分成兩組：繼發性肺結核患者（TB）組及艾滋病合并繼發性肺結核患者（AIDS/TB）組。診斷標準：艾滋病的診斷標準參照《中國艾滋病診療指南（2018版）》[6]， 肺結核的診斷參照《肺結核的診斷標準 （WS288-2017）》[7]。繼發性肺結核確診標準：具備繼發性肺結核影像學表現特征且符合以下條件之一：（1）2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；（2）分枝桿菌培養陽性，菌種鑒定為結核分枝桿菌復合群；（3）結核分枝桿菌核酸檢測陽性；（4）肺組織或肺外組織病理學檢查證實為結核病變。AIDS/TB組，除符合TB組的條件外，還要符合以下條件：（1）HIV抗體篩查試驗陽性和HIV補充實驗陽性；（2）CD4+T淋巴細胞計數＜350個/μL。納入標準：（1）年齡大于18歲；（2）肺結核初治；（3）知情同意，能配合完成相關檢查者。排除標準：（1）免疫抑制劑和免疫增強劑使用者；（2）合并其他免疫功能異常疾病者；（3）合并其他嚴重感染者。最終符合入組的患者209例，AIDS/TB組77例，TB組132例。

1.2 研究方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測方法 試劑盒購自廣東希格生物科技有限公司。抽取患者外周靜脈血5 mL，加至含肝素的采血管中，然后按照T-SPOT.TB試劑盒的使用說明操作，陽性判斷值參考說明書：當N孔斑點數≤10，P孔斑點數≥20或P孔斑點數≤19，T孔-N孔斑點數≥11為陽性；當11≤N孔斑點數≤20，P孔斑點數≥20或P孔斑點數≤19，T孔-N孔斑點數≥N為陽性；當N孔斑點數＞20，結果判斷不確定。

1.2.2 Gene Xpert MTB/RIF檢測 Gene Xpert及測試盒購自Cepheid公司。取研究對象1份晨痰或BALF樣本,按《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》進行N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化處理,消化后的菌液重懸于1.1 mL的磷酸鹽緩沖液中，取0.5 mL用于Xpert MTB/RIF系統檢測。

1.3 觀察指標

各組病例T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養檢測陽性率；以臨床診斷結果為參考標準，四種檢測方法在AIDS/TB組患者中的敏感性及特異性；不同CD4+T水平艾滋病合并繼發性肺結核患者T-SPOT.TB、Gene Xpert結果比較。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床診斷結果

最終符合入組的患者中，AIDS/TB組77例，TB組132例。AIDS/TB組77例患者中，男52例，女25例，平均年齡（45.2±15.8）歲；TB組132例患者中，男75例，女57例，平均年齡（48.4±17.3）歲。

2.2 四種不同檢測方法的陽性率

各組病例T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養檢測結果見表1。在AIDS/TB組中，四種檢測方法的陽性率分別為T-SPOT.TB79.22%（61/77），Gene Xpert MTB/RIF 54.55%（42/77）、痰涂片36.36%（28/77）、痰培養40.26%（31/77）；在TB組中，四種檢測方法的陽性率分別為T-SPOT.TB80.30%（106/132），Gene Xpert MTB/RIF 62.88%（83/132）、痰涂片41.67%（55/132）、痰培養57.58%（76/132），兩組患者同種檢測方法的陽性率比較：T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片陽性率經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組患者痰培養陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）。在艾滋病合并繼發性肺結核患者中，T-SPOT.TB方法陽性率與其他三種方法比較差異有統計學意義（P＜0.001），而Gene Xpert、痰涂片、痰培養分別與另外三種方法比較只有部分有統計學差異：Gene Xpert與痰涂片比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與痰培養比較差異無統計學意義（P＞0.05）；痰涂片與痰培養比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 四種檢測方法陽性率（%）

2.3 四種檢測方法在AIDS/TB組患者中的診斷效能比較

T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養診斷AIDS/TB組患者效能比較以臨床診斷為參考標準，四種檢測方法在AIDS/TB組患者中的敏感性及特異性情況見表2。該組患者中T-SPOT.TB敏感性達79.22%，明顯較Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養的敏感性高，而特異性方面Gene Xpert達100%，高于其他方法。

表2 T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養診斷艾滋病合并繼發性肺結核效能比較（%）

2.4 CD4+T淋巴細胞計數與T-SPOT.TB、Gene Xpert陽性率

在AIDS/TB組的77例患者中，CD4+T≥200個/μL的繼發性肺結核中36例T-SPOT.TB陽性，陽性率59.02%，CD4+T＜200個/μL的繼發性肺結核中25例T-SPOT.TB陽性率40.98%，兩組陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。CD4+T≥200個/μL的繼發性肺結核中Gene Xpert陽性率54.76%，CD4+T＜200個/μL的繼發性肺結核中GeneXpert陽性率45.24%，兩組陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同CD4+T水平艾滋病合并患者繼發性肺結核T-SPOT.TB、Gene Xpert結果（%）

3 討論

結核病是艾滋病最常見的機會性感染，與艾滋病互相促進病變進展、惡化，甚至迅速導致死亡。AIDS/TB患者中，繼發性肺結核的臨床癥狀、體征、實驗室檢查及影像學表現等與普通肺結核表現不一致，易造成臨床誤診漏診，如果能夠盡早明確診斷，及時規范治療后多數患者肺結核可以治愈，艾滋病預后也能改善，因此繼發性肺結核的早期診斷非常重要。目前在基層醫院，肺結核的檢測方法有限，基本限于結核菌素試驗、痰涂片、痰培養及胸部影像學檢查，但結核菌素試驗受影響因素較多，假陽性率高，痰涂片找抗酸桿菌操作雖然簡單，但檢出率低，陽性率僅40%左右，且涂片檢出不能分辨活菌、死菌，不能鑒別結核分枝桿菌或非結核分枝桿菌[8]；結核菌培養可以通過觀察細菌生長情況并進一步進行菌種鑒定和藥敏試驗，但培養陽性率更低，且至少需要4周，時間較長，難以滿足臨床早期診斷的需求,而胸部影像學檢查缺乏特異性。因此，基層醫院需要探索更特異、敏感、快速、簡單，能在基層醫院開展的結核病診斷方法[9]。

T-SPOT.TB是將結核菌特異性抗原加入受試者的血液標本或者含有分離出的外周血單核細胞的培養基中進行孵化，如果受試者受到過結核分枝桿菌感染，那么被結核菌激活的記憶T細胞就會對這些特異性抗原產生反應，發生增殖分化并釋放出γ-干擾素以及其他一些細胞因子，我們可以通過ELISA或ELISPOT方法定量檢測γ-干擾素的釋放水平，判斷是否存在結核菌感染。T-SPOT.TB在普通肺結核應用有不少研究見于報道，具有高敏感性和高特異性，并且不受卡介苗和大多數非致病分枝桿菌的影響，T-SPOT.TB在結核診斷中的意義正在被越來越多的臨床實驗所證[5]，但在艾滋病合并繼發性肺結核患者診斷應用研究較少。艾滋病由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起，HIV把人體免疫系統中最重要的CD4T淋巴細胞作為主要攻擊目標，大量破壞該細胞，使人體喪失免疫功能。CD4T淋巴細胞會否影響T-SPOT.TB結果，本研究通過觀察在77例艾滋病合并繼發性肺結核患者患者中，T-SPOT.TB陽性率79.22%（61/77），普通肺結核患者T-SPOT.TB陽性率80.30%，兩組患者陽性率比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義。艾滋病組患者中T-SPOT.TB敏感性達79.22%，敏感性明顯高于Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培養三種方法。本研究也觀察到艾滋病組CD4+T≥200個/μl的患者T-SPOT.TB陽性率59.02%，CD4+T＜200個/μl患者的T-SPOT.TB陽性率40.98%，不同CD4+T細胞水平陽性率差異無統計學意義。因此，本研究觀察到CD4T淋巴細胞水平與T-SPOT.TB結果沒有明顯相關性，T-SPOT.TB在艾滋病合并活動性肺結核患者中敏感性達79.22%，特異性89.29%，T-SPOT.TB對于診斷艾滋病合并繼發性肺結核有臨床價值[10]。但也要注意，T-SPOT.TB陽性不能區分活動性結核感染或潛伏的結核感染，診斷時需綜合其他方法判斷，T-SPOT.TB陰性時，可排除結核菌感染，在判斷結核菌還是非結核菌感染時有較高臨床價值[11]。

Gene Xpert MTB/RIF分子診斷系統，是全自動一體化的基于PCR方法的核酸檢測系統，基于Gene Xpert平臺的結核分枝桿菌及利福平耐藥檢測僅需2小時即可從原始標本獲得結果，比傳統的熒光定量PCR檢測方法更準確、安全、快速，生物安全性要求不高，且能同時檢測利福平耐藥，可以在基層醫院開展[12]。本研究顯示艾滋病組患者中Gene Xpert敏感性達54.55%，特異性達100%，不同CD4+T水平患者在敏感性、特異性方面無統計學差異。特異性明顯高于T-SPOT.TB、痰涂片、痰培養三種方法，在快速診斷方面有明顯優勢，但Gene Xpert檢測的是基因片段，無法判斷是死菌還是活菌，且由于采用痰標本，結果受痰標本質量影響[13]。

綜上所述，診斷艾滋病合并活動性肺結核時，T-SPOT.TB具有較高的敏感性，Gene Xpert有較高的特異性，兩者用于艾滋病患者合并繼發性肺結核的輔助診斷有一定的臨床價值。