人源性CC103無乳鏈球菌主要ST的耐藥特點及分子流行特征*

程招敏，藍 鍇，王云秀，黎小瓊，柯培鋒△，李 亮

1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，廣東廣州 510120；2.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院醫學技術系，廣西南寧530200

無乳鏈球菌又稱為B群鏈球菌(GBS),是育齡期女性的直腸和生殖道中常見的定植菌。妊娠晚期無乳鏈球菌的定植，是引起產婦宮內感染和嚴重新生兒感染的主要原因[1]。了解育齡期女性中定植無乳鏈球菌的耐藥特點和分子流行特征，對妊娠不良結局的防控有重要作用。通過多位點序列分型(MLST)可將無乳鏈球菌分為不同的序列型(ST)，并歸為不同的克隆群(CC)。大多數人源菌株源于5個CC(CC1、CC10、CC17、CC19、CC23)[2]。國外研究表明，CC103菌株主要引起奶牛乳腺炎[3]，然而2015-2017年，國內人源性CC103菌株的分離率從1.25%增加至21.74%，尤其是ST485已成為主要的人源性ST之一，且分離率明顯高于國外的報道[2-4]。然而，國內關于人源性CC103菌株主要流行的ST，以及其耐藥性、分子流行病學研究鮮有報道。本研究擬對廣州地區妊娠期女性定植CC103無乳鏈球菌的ST分布進行分析，并對其耐藥性、主要耐藥基因、血清型分布及主要毒力基因進行調查，旨在為該地區CC103菌株引起感染的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究收集的137株無乳鏈球菌均為非重復菌株，分離于2018-2019年在廣州中醫藥大學第二附屬醫院就診的妊娠期女性的陰道-直腸拭子標本。標準菌株大腸埃希菌ATCC8739和肺炎鏈球菌ATCC49619購于美國典型菌種保藏中心。標準菌株無乳鏈球菌ATCC12403和A909由南華大學陳麗麗老師惠贈。

1.2儀器與試劑 水解酪蛋白(M-H)瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板(江門凱琳公司)、藥敏紙片(英國Oxoid公司)、細菌基因組DNA提取和Premix Taq試劑盒(大連TakaRa公司)、VITEK MS質譜儀及相關試劑(法國bioMérieux公司)、VITEK-2全自動細菌鑒定/藥敏分析儀及相關檢測試劑(法國bioMérieux公司)、PCR擴增儀(美國ABI公司)、核酸凝膠電泳儀及凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。本實驗MLST、血清學分型、耐藥基因和毒力基因檢測所需的引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1菌株復蘇及鑒定 將收集的試驗菌株轉種于血平板上，在37 ℃、5.00% CO2條件下，孵育24 h，同時采用VITEK MS質譜儀和VITEK-2細菌鑒定儀對所有試驗菌株進行鑒定。

1.3.2DNA提取 細菌基因組DNA提取參照試劑說明書的要求和操作步驟進行，提取的DNA置于-80 ℃待用。

1.3.3MLST分型 參照JONES等[5]報道的實驗條件和方法，采用PCR技術對adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt等7個管家基因進行擴增，并將擴增產物送上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析。運用MEGA6軟件對所獲取的所有試驗菌株的同一基因進行剪齊，將經過剪齊的序列上傳至MLST分型在線數據庫(http://pubmlst.org/sagalactiae/)，獲取各菌株各管家基因的等位基因數，通過7個管家基因的等位基因數確定各菌株的序列型。用eBURST3.1軟件對所有序列型進行分析并歸為不同CC。

1.3.4抗菌藥物敏感試驗 參照2019版美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)抗菌藥物敏感試驗指南(http://www.clsi.org)的試驗要求和藥敏判斷標準，檢測各試驗菌株對青霉素(10 μg)、紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、四環素(30 μg)、氯霉素(30 μg)、利奈唑胺(30 μg)、萬古霉素(30 μg)等7種抗菌藥物的敏感性。藥敏試驗質控菌株根據CLSI要求，采用標準菌株ATCC49619。

1.3.5耐藥基因檢測 采用PCR技術分別擴增CC103菌株的紅霉素和克林霉素耐藥基因(ermB、mefA/E、ermTR基因、linB基因)，反應條件和引物采用何其勵等[6]的報道，根據各菌株擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果確定其是否攜帶耐藥基因。

1.3.6毒力基因檢測 采用PCR技術分別擴增CC103菌株的主要毒力基因:CAMP因子基因(cfa)、α-C蛋白基因(bca)、β-C蛋白基因(bac)、5Ca肽酶基因(scpB)和層黏連蛋白基因(lmb)。引物和反應條件參照JIANG等[7]的報道，通過擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果確定各菌株是否攜帶毒力基因。

1.3.7分子血清學分型 參照IMPERI等[8]建立的方法，采用多重PCR技術，擴增莢膜多糖(CPS)合成基因，通過瓊脂糖凝膠電泳確定各CC103菌株的血清型。以標準菌株ATCC12403(血清學 Ⅲ型)和A909(血清學Ⅰa型)為血清分型的參考菌株。

1.4統計學處理 藥敏試驗結果用WHONET5.6軟件統計分析。統計學分析用SPSS22.0軟件進行，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1菌株鑒定 收集的137株試驗菌株，均同時采用VITEK MS質譜儀和VITEK-2全自動細菌鑒定儀鑒定，其結果均為無乳鏈球菌。

2.2MLST分型結果 MLST分型結果如圖1所示，137株無乳鏈球菌被分為19種ST，以ST19和ST17為主，分別占28.50%和13.10%，其他主要的ST包括ST485、ST862、ST651、ST27等，19種ST來源于7個CC。CC103占26.30%(36/137)，共發現4種來源于CC103的ST,分別為ST485(9.50%)、ST862(7.30%)、ST651(7.30%)、ST103(2.20%)。此外，聚類分析顯示ST485與ST862，ST651與ST103的親緣關系更近。

圖1 19種ST無乳鏈球菌的聚類分析圖

2.3抗菌藥物敏感試驗結果 137株無乳鏈球菌對青霉素、利奈唑胺和萬古霉素均敏感(敏感率為100.00%)。CC103對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素、四環素的耐藥情況見表1。CC103菌株對紅霉素、左氧氟沙星和四環素耐藥率與非CC103菌株比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，即CC103菌株紅霉素、左氧氟沙星和四環素的耐藥率低于非CC103菌株。ST651和ST862對紅霉素、克林霉素和氯霉素的耐藥率以及兩者的多重耐藥率均>60.00%。

表1 人源性CC103無乳鏈球菌與非CC103菌株的耐藥性比較[n(%)]

2.4耐藥基因檢測結果 耐藥基因擴增后電泳圖見圖2。對紅霉素耐藥的ST651菌株ermB基因陽性率為100.00%(7/7)，未檢出mefA/E和ermTR兩種耐藥基因；對紅霉素耐藥的ST862菌株ermB和mefA/E基因的陽性率均為100.00%(8/8)，未檢出ermTR基因；對克林霉素耐藥的所有CC103菌株，linB基因陽性率為100.00%(14/14)。

注：a為ermB基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2為陽性標本；b為mefA/E基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2和3為陽性標本；c為linB基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2為陽性標本。

2.5分子血清學分型結果 分子血清學分型的電泳見圖3。36株CC103無乳鏈球菌共檢出Ⅰa型和Ⅲ型兩種血清型，其中ST103和ST485均為血清學Ⅰa型，而ST651和ST862菌株均為血清學Ⅲ型。

注：M為DL1000標志物；1為ATCC12403無乳鏈球菌(血清學Ⅲ型陽性對照)；2為A909無乳鏈球菌(血清學Ⅰa型陽性對照)；3、4、6為實驗菌株(血清學Ⅲ型)；5為實驗菌株(血清學Ⅰa型)。

2.6毒力基因檢測結果 5種主要毒力基因的電泳見圖4，bca、cfb、bac、scpB、lmb檢出率依次為100.00%(36/36)、100.00%(36/36)、30.60%(11/36)、25.00%(9/36)和27.80%(10/36)。

注：a為bca基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2和3為陽性標本；b為cfa基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2為陽性標本；c為bac基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2和3為陽性標本；d為scpB基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2和3為陽性標本；e為lmb基因，M為DL1000標志物，1為陰性對照，2為陽性標本。

3 討 論

有研究表明，定植無乳鏈球菌的表型和基因型均存地理區域性差異，且定植無乳鏈球菌可引起流產、胎膜早破、產后宮內感染和新生兒感染等不良妊娠結局[9-10]。因此，了解某地區的定植無乳鏈球菌的ST和血清型分布、耐藥性及所攜帶的耐藥基因、毒力因子等菌群特征，對該地區無乳鏈球菌引起不良妊娠結局的防控至關重要。據國外文獻報道，CC103菌株主要引起動物感染，以牛乳腺炎多見，人源性菌株較為少見[3]。然而，已有研究表明，人源性CC103定植菌株在我國的分離率呈上升趨勢[1,2,4]，但這些報道并未對CC103菌株的耐藥性和分子流行病學特征進行系統性研究。本研究是首次對廣州地區的人源性CC103菌株進行全面的分子流行病學調查和耐藥性分析。

利用MLST對某地區的定植無乳鏈球菌進行分型，可了解其系統發育譜系特征。本研究共檢出19種ST，來源于7個CC，這表明廣州地區的定植無乳鏈球菌具有較高的遺傳多態性。雖然本研究ST種類相對較多，但仍以ST19(28.50%)和ST17(13.10%)為主，這和來自其他地區的報道[11-12]相似。本研究通過eBURST3.1軟件對所有ST進行歸類分析，表明該地區CC103(26.30%)已成為僅次于CC19(42.30%)的主要定植菌株之一，CC103所占比例以及主要ST組成均與廣西地區的報道[4]相似。此外，有研究報道，收集了2017年分離于廣東省婦幼保健院的定植無乳鏈球菌72株，結果顯示CC103占23.50%，且主要ST分布也和本研究相似[1]。據此，本文推測CC103是華南地區流行的主要定植株之一，且其主要ST分布相似，但這需要更多的來自于華南地區的流行病學數據才能支持該推測。研究表明，北京[12]和上海[7]地區的人源性CC103菌株以ST485或ST103為主，未發現ST651和ST862菌株，且CC103所占比例低于本研究和廣西地區的報道。這表明同一CC的ST分布可能會因地理區域不同而存在差異。

目前，對于無乳鏈球菌引起妊娠不良結局的產時抗菌藥物預防，指南多推薦采用青霉素作為首選藥物[13]。本研究中的定植菌株對青霉素均敏感，這證實青霉素可作為本地區產時抗菌藥物預防的經驗性用藥選擇。對于青霉素過敏的孕婦而言，紅霉素和克林霉素是其產時抗菌藥物預防的重要替代藥物[1]。但國內外的報道均表明無乳鏈球菌對兩者的耐藥率呈上升趨勢[14-15]。本研究中，定植菌株對紅霉素(67.20%)和克林霉素(47.40%)的耐藥率較高，這與北京[16]、烏魯木齊[17]、深圳[18]等國內城市相似。因此，采用紅霉素或克林霉素進行產時抗菌藥物預防，建議根據藥敏結果選擇藥物。本研究中，CC103菌株對于紅霉素、左氧氟沙星和四環素的耐藥率以及多重耐藥率均低于非CC103菌株，差異有統計學意義(均P<0.05)，這表明不同CC的定植菌株耐藥性存在差異。本研究中，定植菌株的耐藥性差異還表現在同一CC的不同ST間，如ST103和ST485對于紅霉素、克林霉素和氯霉素均敏感，而ST651和ST862對3者耐藥率均>60.00%。此外，有研究表明廣州地區定植菌株對四環素的耐藥率較高(耐藥率>80.00%)[1,19]，但本研究的CC103菌株中僅ST485對四環素耐藥率(84.60%)較高，而其他3種ST的耐藥率均<10.00%，這也進一步表明同一CC的不同ST的耐藥性的差異。無乳鏈球菌對紅霉素耐藥主要由ermB、mefA/E、ermTR基因介導，而linB基因主要是介導其對紅霉素中介和克林霉素耐藥[20]。耐藥基因檢測結果表明，ST651與ST862對紅霉素的耐藥機制不完全相同，前者對紅霉素的耐藥主要由ermB基因介導，而后者由ermB和mefA/E基因同時介導；ST651和ST862對克林霉素耐藥均與linB基因有關。

無乳鏈球菌的莢膜多糖是其重要的毒力因子[20]。因此，根據莢膜多糖的抗原性不同對無乳鏈球菌進行血清學分型，對了解其致病性至關重要。此外，莢膜多糖還是疫苗設計的重要靶點[20]，了解某地區的無乳鏈球菌血清型分布，對開發適用于該地區的莢膜多糖疫苗有重要價值。分子血清學分型結果表明，本研究中人源性CC103菌株的ST有與其相對應的特定血清型，如：ST103和ST485均為Ⅰa型，ST651和ST862菌株均為Ⅲ型，這與WANG[2]報道相似。無乳鏈球菌的致病性不僅取決于莢膜多糖，還與多種毒力因子相關[18]。本研究共檢測了參與編碼黏附、侵襲及免疫逃逸相關蛋白的5種主要毒力基因(bca、cfb、bac、scpB、lmb)，結果顯示，與侵襲力相關的毒力基因bca和cfa存在于所有CC103菌株中，而bac、scpB、lmb的檢出率均<33.00%。此外，特定ST的CC103菌株毒力基因譜相對固定，且不同ST毒力基因譜存在差異。換而言之，部分毒力基因分布因ST而異，如：參與宿主細胞黏附的毒力基因lmb主要分布于ST103和ST862；與免疫逃逸相關的毒力基因bac主要分布于ST651。

綜上所述，廣州地區的定植無乳鏈球菌具有較高的遺傳多態性，CC103菌株已成為該地區流行的主要的人源性CC之一。該地區人源性CC103菌株主要由ST103、ST485、ST651、ST862組成，其中ST651和ST862對紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，但對紅霉素耐藥的機制不同。此外，4種ST的血清型和毒力基因分布存在差異。總體上，本研究初步闡明了廣州地區人源性CC103無乳鏈球菌的主要ST分布、耐藥特點和分子流性特征。但相對于廣州地區的龐大人口基數而言，本研究收集的樣本量相對較少，若要深入了解該地區人源性CC103菌株的耐藥特點和分子流行特征，尚需擴大樣本量進一步研究。