A型核纖層蛋白編碼基因LMNA調控IOP1表達機制的初步研究*

孔令粵，劉佳鑫，郭 放，郭 濤，馮安妮，趙仕滔，黃浚煒，劉新光，趙 煒△

1.廣東醫科大學衰老研究所，廣東東莞 523808；2.廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；3.廣東醫科大學第二臨床醫學院，廣東東莞 523808；4.廣東醫科大學醫學技術學院，廣東東莞 523808；5.廣東醫科大學基礎醫學院，廣東東莞 523808

早老癥(HGPS)是由于A型核纖層蛋白的編碼基因(LMNA)發生突變[1-3]，產生異常剪接的蛋白(早老素)，在細胞核內堆積引發的具有早老特征的疾病[4]。研究發現，使用自噬誘導劑蛋白酶體抑制劑(MG132)處理HGPS患者的成纖維細胞，可以有效改善細胞的早老表型[5],暗示LMNA基因和細胞自噬之間存在一定的聯系，但是具體調控機制尚不清楚。人的唯鐵脫氫酶編碼基因1(IOP1)是一種鐵硫蛋白，主要參與細胞質和細胞核中鐵硫蛋白的合成[6]。本課題組在前期研究中發現LMNA和IOP1之間可能存在相互調控關系，本研究著重探討兩者之間，特別是它們在細胞自噬中潛在的調控機制，希望為HGPS的治療提供借鑒。現報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料 人胚胎腎細胞(HEK293T)為本實驗室保存。胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養基、Lipofectamine RNAiMAX、IOP1-siRNA (ID:HSS148890)、LMNA-siRNA (ID:HSS106094)及50 nmol/L陰性對照NC-siRNA (12935400)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser) 購自日本Takara公司。RIPA裂解液、PMSF、 5×Loading Buffer 均購自中國碧云天生物技術有限公司。TGX Stain-Free FastCast Acrylamide試劑盒購自美國Bio-Rad公司，0.2 μmol/L PVDF膜購自德國Merck Millipore公司，牛血清清蛋白(BSA)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，AP標記二抗購自美國Proteintech公司，NBT/BCIP購自美國Sigma公司。IOP1抗體、Lamin A/C抗體、LC3BⅠ抗體、LC3BⅡ抗體、FOXO3a抗體、p62抗體、ATG5、ATG12抗體、GAPDH抗體均購自美國CST公司。熒光定量PCR儀型號為LightCycler 480，購自瑞士羅氏公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HEK293T在37 ℃，5% CO2培養箱中用含10% FBS的高糖DMEM培養基培養。

1.2.2siRNA干擾實驗 將HEK293T接種于6孔板中，當細胞密度達到30%～50%時進行轉染。用Lipofectamine RNAiMAX轉染終濃度為50 nmol/L 的IOP1-siRNA、LMNA-siRNA及50 nmol/L陰性對照NC-siRNA。用于提取總RNA的細胞在轉染后48 h收集，用于提取總蛋白的細胞在轉染后96 h收集。

1.2.3熒光定量PCR 采用兩步法進行熒光定量PCR，先使用Trizol法提取細胞總RNA,按照cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)的操作說明，取1 μg RNA用于反轉錄合成cDNA，然后采用SYBR Green法在LightCycler 480儀器上進行熒光定量PCR。IOP1基因的定量引物序列為5′-GAA AAA AGG GCG GGA AGT GPC R-3′和5′-GCT CCC GTC ATC TTC AAT GC-3′，LMNA基因的定量引物序列為5′-TGG ACG AGT ACC AGG AGC TT-3′和5′-ACT CCA GTT TGC GCT TTT TG-3′，內參基因GAPDH的定量引物序列為5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′和5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′。反應條件為：95 ℃ 1 min預變性；95 ℃ 5 s變性，55 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸；循環數40次。

1.2.4Western Blotting 收集細胞后，加入RIPA裂解液及PMSF，冰上裂解30 min，加入5×Loading Buffer，100 ℃水浴10 min。使用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide試劑盒配制12% PAGE膠,電泳后將蛋白質轉移到0.2 μmol/L PVDF膜,3% BSA室溫封閉1 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBST漂洗3次后，加入AP標記的對應二抗，室溫孵育1 h。通過NBT/BCIP法顯色。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。兩組間比較采用t檢驗進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1在HEK293T中干擾LMNA的表達對IOP1和細胞自噬的影響 有文獻報道在小鼠中敲除LMNA基因后，細胞自噬的標志物之一LC3BⅡ/LC3BⅠ的比例上調[7]。為了在細胞水平研究LMNA與自噬的關系，本文在HEK293T中轉染靶向LMNA基因的siRNA，進而檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的表達水平。熒光定量PCR分析結果見圖1A，與NC對照組相比，在轉染了靶向LMNA基因siRNA的實驗組中，LMNA的mRNA干擾效率達到85%。LMNA蛋白水平明顯下調，見圖1B。

本文進一步通過Western Blotting檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的相對比例(圖1B)，結果顯示，與NC對照組相比，LC3BⅡ/LC3BⅠ的比例上調，表明在HEK293T中下調LMNA基因的表達水平，可以上調細胞的自噬水平。轉染了靶向LMNA基因的siRNA的HEK293T中，IOP1的mRNA轉錄水平和蛋白水平都明顯下調，這表明LMNA基因、IOP1基因和自噬之間可能存在調控關系。

注：與NC對照組比較，*P<0.05。

2.2在HEK293T中干擾IOP1的表達對LMNA基因的影響 鑒于在HEK293T中干擾LMNA基因的表達，IOP1基因的mRNA轉錄水平和蛋白水平都明顯下調，本文在HEK293T中轉染靶向IOP1基因的siRNA，進而檢測LMNA基因的表達水平。與NC對照組相比，在轉染了靶向IOP1的siRNA的實驗組中，IOP1基因的mRNA(圖2A)和蛋白水平明顯下調，見圖2B。然而，LMNA基因的mRNA和蛋白水平都沒有明顯改變。結果表明，在HEK293T中干擾IOP1基因的表達不影響LMNA基因的表達水平。

注：與NC對照組比較，*P<0.05。

2.3在HEK293T中干擾IOP1基因的表達對細胞自噬的影響 為了進一步研究LMNA基因、IOP1基因和自噬之間潛在的調控關系，本文在轉染了靶向IOP1基因siRNA的HEK293T中(IOP1基因的表達水平被證實下調，圖3A)，通過Western Blotting檢測多個細胞自噬的標志物：LC3BⅡ/LC3BⅠ、p62、ATG5-ATG12復合體、ATG5和ATG12。結果顯示(圖3B)，LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值升高，FOXO3a、ATG5、ATG12、ATG5-ATG12復合體蛋白水平升高，p62蛋白水平略有降低，暗示細胞的自噬水平上升。

注：與NC對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

鐵硫蛋白是以鐵原子和硫原子組成的鐵硫簇為輔基的一大類蛋白，參與眾多生理過程，如細胞代謝、呼吸鏈電子傳遞、DNA合成修復以及基因表達調控等[8]。有研究報道，在人乳腺癌細胞和小鼠細胞中沉默鐵硫蛋白NAF-1的表達，可以激活自噬[9]；鐵硫蛋白NEET蛋白參與信號傳導、凋亡、自噬等多種細胞活動[10]。這些研究提示，鐵硫蛋白很可能在細胞自噬中起著重要作用。但是，IOP1基因作為鐵硫蛋白家族中的一員，是否參與調控調細胞自噬，鮮見相關報道。

有研究報道，在二倍體釀酒酵母中缺失NAR1基因(人類IOP1基因在酵母中的同源基因) 的一個拷貝，會明顯縮短酵母的復制性壽命，表明NAR1及其人類同源基因IOP1基因很可能在細胞衰老中起重要作用[11]。另外，IOP1基因的另一個人類同源基因IOP2(也叫NARF)能與A型核纖層蛋白前體相互結合[12]，LMNA基因突變會導致以HGPS為代表的一系列核纖層蛋白疾病。研究發現，核纖層蛋白病的細胞樣本中都存在細胞自噬受損現象，使用mTOR藥物抑制劑(可以激活自噬)處理后可以有效緩解細胞病理的相關表型[5]。

本文在HEK293T中轉染靶向LMNA基因的siRNA之后，細胞自噬的標志物之一LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值上調,同時，IOP1的mRNA轉錄水平和蛋白水平都明顯下調，這表明下調LMNA基因的表達，可以有效降低IOP1基因的表達水平，反之，下調IOP1基因的表達，不會影響LMNA基因的表達水平。這表明LMNA基因對IOP1基因存在單向的調控關系。

為了進一步探討IOP1基因是否也參與調控細胞自噬，本研究在HEK293T中轉染靶向IOP1基因的siRNA，直接降低IOP1基因的表達水平，進而檢測自噬標志物的表達情況。結果顯示，LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值、FOXO3a、ATG5、ATG12、ATG5-ATG12復合體蛋白水平升高，p62蛋白水平略有降低。

在哺乳動物細胞中，LC3蛋白可以被ATG4剪切形成LC3-Ⅰ，誘導自噬后，LC3-Ⅰ通過ATG7、ATG3和ATG12-ATG5-ATG16L多聚體與高親脂性磷脂酰乙醇胺(PE)部分結合，轉變為(自噬體)膜型LC3(即LC3-Ⅱ)。因此，LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值越大，提示自噬水平越高。p62是LC3-Ⅱ的自噬底物蛋白，與LC3Ⅱ呈負相關關系[13]。

FOXO3a是FOXO轉錄因子家族成員之一，在細胞衰老、凋亡、自噬中起著重要作用。研究發現，FOXO3A可以直接與自噬相關基因的啟動子，例如LC3B、ATG12結合，進而激活細胞自噬，減緩環境壓力對細胞的毒害作用[14-16]。

綜合這些細胞自噬標志物的檢測結果，本文推測在HEK293T中干擾LMNA基因的表達后，可能通過下調IOP1基因的表達，進而上調轉錄因子FOXO3a的表達水平，最終導致自噬相關基因的表達。

綜上所述，在HEK293T中LMNA基因可以調控IOP1基因的表達，進而參與調控細胞自噬過程。而LMNA基因通過何種途徑調控IOP1基因的表達，是直接調控，還是通過其他信號通路間接調控，相關的分子機制尚需要更深入的研究。