口腔白斑病癌變的血管生成基因芯片檢測及表達驗證

吳蘇寧 楊溪 劉偉

口腔白斑是最重要的口腔黏膜潛在惡性疾病，是口腔鱗狀細胞癌的重要來源［1］，調(diào)查顯示國內(nèi)白斑患者的癌變率為4%～18%［2－4］。上皮異常增生是白斑重要的病理特征，從無異常增生、輕－中－重度異常增生到癌變進程各階段較明確，白斑的發(fā)生發(fā)展到癌變是腫瘤發(fā)生的良好研究模型。血管生成是腫瘤發(fā)生的標志事件之一，《自然》系列雜志發(fā)表通過抗血管生成預防癌癥發(fā)生和發(fā)展的綜述［5］，表明腫瘤血管生成早于組織形態(tài)學如上皮異常增生改變之前。雖然單個或幾個血管生成相關蛋白表達在白斑癌變中進行研究具有一定意義［6－8］，但是高通量的組學研究可能更具有意義。本文作者利用人轉錄組芯片研究口腔白斑患者病損發(fā)生發(fā)展中的血管生成基因表達譜，并驗證關鍵基因的表達。

1 材料與方法

1.1 基本材料

標本來源納入轉錄組芯片研究的患者組織包括3例正常口腔黏膜，8例口腔白斑，6例口腔早期鱗癌（T1-2N0M0），收集于2014年9月～2014年12月上海第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科。納入8例口腔白斑分為4例無/輕度上皮異常增生，4例中－重度上皮異常增生，分別歸為本研究中的低危白斑和高危白斑。納入差異基因的驗證表達研究的患者組織包括6例正常黏膜，12例口腔白斑，12例口腔早期鱗癌，收集于2018年6月～2018年12月上海第九人民醫(yī)院頜面頭頸腫瘤科。以上組織病理學診斷由上海第九人民醫(yī)院口腔病理科醫(yī)師確認。組織樣本為活檢或手術后標本，放入裝有RNAlater液的凍存管，離體后液氮浸沒15 min，放入－80℃冰箱保存。所有患者術前均未進行化療、放療及激素等治療，且無自身系統(tǒng)性疾病和癌癥史。正常黏膜、口腔白斑和鱗癌3組間的年齡和性別等因素無統(tǒng)計學差異。本研究獲得上海第九人民醫(yī)院倫理委員會批準（批號：［2012］21），研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA提取和質(zhì)檢 按照 TRIzol試劑盒（15596型號，Invitrogen公司，美國）常規(guī)提取組織中總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計（ND2000型，Thermo Scientific公司，美國）測定濃度及 A260/A280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。納入本研究的組織樣本NanoDrop ND-2000定量并經(jīng) Agilent Bioanalyzer 2100（安捷倫2100，Agilent Technologies公司，美國）檢測RNA完整性，檢測顯示RNA的A260nm/A280nm比率均在 1.8和 2.1之間，A260nm/A230nm值均大于1.8，顯示RNA質(zhì)量良好，符合實驗要求。

1.2.2 轉錄組芯片研究 樣本的標記、轉錄組學芯片的雜交以及洗脫檢測按照Affymetrix GeneChip?Hu-man Transcriptome Array（HTA）2.0標準流程執(zhí)行。首先，總 RNA反轉錄成雙鏈 cDNA，再進一步合成cRNA，接著對cRNA進行第二輪反轉錄合成cDNA，片段化并與生物素標記后與芯片雜交，洗脫和染色后利用Affymetrix Scanner3000（Affymetrix，美國）掃描得到原始圖像。采用Affymetrix GeneChip Command Console軟件處理提取原始數(shù)據(jù)和Expression Console軟件對芯片進行gene level的標準化，標準化算法為RMA。后續(xù)分析分成基因表達分析使用的軟件為Genespring軟件。差異基因利用t檢驗的P值和倍數(shù)變化值進行篩選，篩選的標準為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值＜0.05。接著，對差異基因進行Gene ontology（GO）功能分析，以判定差異基因主要影響的生物學功能。最后，對差異基因進行非監(jiān)督層次聚類，展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

1.2.3 熒光定量 PCR（qRT-RCR） 利用 HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）將待測 RNA逆轉錄成cDNA。采用Roche LCPDS2軟件設計基因引物（表1）。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，Germany）在 LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進行反應。體系：2×QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix，5μL；10 μmol/L Forward primer，0.2μL；10μmol/L Reverse primer，0.2μL；cDNA，1μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95℃5 min；95℃10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。循環(huán)結束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每℃采集5次熒光信號。GAPDH作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法測定相對表達水平，設置3個重復孔，計算其均數(shù)和標準差。

表1 RT-qRCR驗證血管生成關鍵基因的引物序列Tab 1 Primer sequence for angiogenic genes

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用方差分析比較正常黏膜、白斑和鱗癌3組間基因定量表達均數(shù)差別的顯著性檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 口腔白斑發(fā)生發(fā)展中的血管生成基因表達譜

本研究將口腔白斑發(fā)生發(fā)展的節(jié)點分為低危（無/輕度異常增生）白斑、高危（中－重度異常增生）白斑和早期鱗癌。經(jīng)Affymetrix HTA2.0轉錄組芯片檢測，低危白斑有855個異常變化兩倍以上特有的轉錄本基因，高危白斑有399特有基因，高危白斑發(fā)展到早期鱗癌有797個特有基因。白斑各階段的差異基因進行GO功能分析。按照GO生物學作用分類，篩選出生物學作用為血管生成（Angiogenesis）的基因（圖1）。

圖1 從白斑發(fā)生發(fā)展各階段全部基因中篩選出血管生成基因Fig 1 Angiogenic genes screened from all genes in the develop-ment and progression of leukoplakia

從正常黏膜發(fā)展到低危白斑有7個異常變化兩倍以上基因，從低危黏膜發(fā)展到高危白斑有8個基因（表2）。從高危白斑發(fā)展到鱗癌有151個基因，占比18.9%，聚類分析表達譜見圖2。

圖2 口腔高危白斑發(fā)展到早期鱗癌的血管生成基因表達譜Fig 2 Angiogenic gene expression profile of high-risk leukoplakia to early SCC

表2 白斑發(fā)生發(fā)展進程中的血管生成差異表達基因Tab 2 Angiogenic genes in the development and progression of leukoplakia

2.2 白斑癌變血管生成關鍵基因的驗證

本研究的芯片驗證關注于從高危白斑發(fā)展到早期鱗癌的血管生成關鍵基因，選擇正常黏膜、口腔白斑和鱗癌的獨立樣本對VEGFA、PDGFRB、MMP1和MMP3行熒光qRT-RCR的驗證表達研究，結果顯示VEGFA、PDGFRB、MMP1和MMP3的mRNA在正常黏膜、口腔白斑和鱗癌中的相對表達量均呈階梯式升高（圖3），這與轉錄組芯片結果基本一致。

圖3 qRT-PCR驗證血管生成基因VEGFA、PDGFRB、MMP1和MMP3在正常黏膜、白斑和鱗癌中的差異表達（P＜0.05）Fig 3 qRT-PCR confirmation of the differential expression of VEGFA，PDGFRB，MMP1 and MMP3 in normalmucosa，leukoplakia and SCC（P＜0.05）

3 討 論

口腔黏膜白斑癌變進程是由多基因異常參與的組織細胞結構和功能改變的多步驟過程，高危白斑的早期診斷及危險評估尤為重要。目前，臨床上常用視診、觸診、常規(guī)病理學進行口腔癌前病變的診斷和評估，而細胞基因改變發(fā)生于組織形態(tài)學改變之前，研究白斑發(fā)生發(fā)展進程中基因組學改變對癌變早期診斷及分子機制方面具有重要作用。組學研究比單個或幾個分子在口腔白斑及鱗癌中表達研究更有意義［6－10］。本研究選取的Affymetrix HTA2.0芯片是新一代全轉錄組芯片，該芯片設計了近700萬條探針，可以檢測超過28萬條全長轉錄本，包括超過24萬條編碼轉錄本RNA和超過4萬條非編碼轉錄本RNA。

納入轉錄組芯片的階梯式病例設置是本研究的特色。針對口腔白斑的發(fā)生發(fā)展設置四組病例，設置為正常黏膜（n＝3）－低危白斑（n＝4）－高危白斑（n＝4）－早期鱗癌（n＝6）模擬白斑癌變的多步驟進程，研究結果可反映白斑癌變不同階段的分子生物學特性。王娟等［11］對正常黏膜（n＝3）和白斑（n＝3）進行的Affymetrix U133 plus 2.0基因芯片研究，張德保等［12］對正常黏膜（n＝10）和白斑（n＝10）進行的Agilent基因組學芯片研究，陳顯久等［13］對白斑（n＝3）和鱗癌（n＝3）進行的SupperArray基因芯片研究。而本研究的芯片病例設置為白斑發(fā)生發(fā)展的各階段，這是區(qū)別于既往的對白斑的芯片研究的特色之處。

血管生成是腫瘤發(fā)生的標志事件之一。研究表明腫瘤超過1～2 mm3須依賴血管生成和氧氣，腫瘤發(fā)生是由于在腫瘤內(nèi)部的細胞不受控的快速分裂增殖，導致大量細胞聚集在一起，卻沒有血管可以帶來養(yǎng)分和氧氣，腫瘤內(nèi)部的細胞通常會陷入低氧環(huán)境中，從而通過 HIF1α開啟或增強一系列基因的表達，通過VEGF等基因上調(diào)促進血管生成，包括促進能量物質(zhì)無氧酵解的酶，導致癌細胞規(guī)避失巢凋亡并啟動遷移機制的信號通路［5］。段寧等［14］對白斑（n＝4）和鱗癌（n＝4）進行單核苷酸多態(tài)性芯片研究，異常基因主要位于第3，5－9，11，13－15，17，18染色體，本項目篩選出的血管生成基因位點亦多位于這些染色體（表2）。

本研究中轉錄組芯片篩選出白斑發(fā)生發(fā)展各階段的血管生成基因。作者發(fā)現(xiàn)S100A7和PDPN分別是低危白斑和高危白斑的異常基因，Kaur等［15］發(fā)現(xiàn)S100A7是預測癌變的標記物，本項目先前的研究提示PDPN亦可能是癌變標記物［16］。VEGFA、PDGFRB、CCL2、EGFR、MMP1/3等是從高危白斑發(fā)展到早期鱗癌階段的關鍵基因，qRT-PCR實驗結果亦顯示VEG-FA、PDGFRB、MMP1和MMP3基因發(fā)生顯著上調(diào)。國外學者報道VEGFA和EGFR免疫表達與白斑進展和癌變相關［17－18］，CCL2與口腔鱗癌中的血管生成有關［19］，MMP1的免疫表達在白斑和正常組織有顯著差異，但作為癌變診斷指標證據(jù)不足［20］。

目前，血管生成基因在口腔癌變進程中分子機制研究很少，本研究結果提示VEGFA等基因上調(diào)促進血管生成在癌變過程中具有重要作用，白斑癌變微環(huán)境中VEGFA等激活的信號通路和分子機制值得進一步研究。總體上，本文以血管生成為論點，為白斑發(fā)病和癌變的分子機制、尋找白斑早期診斷的分子標記的深入研究提供新依據(jù)，為白斑的發(fā)生發(fā)展機制和標志性癌變基因探針的篩查奠定了基礎。