α7n 型乙酰膽堿能受體在小膠質細胞中下調炎癥水平的作用及其機制研究

沈 越，張靜靜，杜 晶，曹 奇，劉 沖，錢 皎 （1. 海軍軍醫大學：a. 長海醫院藥學部, b. 藥學院，上海，00433; . 濟寧醫學院藥學院，山東 濟寧，7686）

小膠質細胞是一種神經膠質細胞，是存在于中樞神經系統中的炎癥免疫相關細胞，相當于中樞神經器官（腦和脊髓）中的巨噬細胞[1]。小膠質細胞的生理作用是清除中樞神經系統中受損的神經組織、通過血腦屏障入侵中樞的感染源及異物等。在病理狀態下，已有多項研究表明，小膠質細胞在多種中樞神經系統疾病的發生發展中發揮重要的作用，包括缺血性腦梗、多發性硬化、神經退行性疾病等[2-3]。因此，抑制小膠質細胞的促炎反應對多種疾病的治療具有重要意義。

α7 n 型乙酰膽堿能受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR）是一種n 型乙酰膽堿能受體亞型，從屬于配體門控的離子通道受體家族[4]。從傳統意義上來說，α7 n 型乙酰膽堿能受體位于神經肌肉接頭后膜，接受傳出神經末梢突觸釋放的化學遞質（Ach）的作用，使得電信號繼續傳播。然而，近年來越來越多的研究表明，激動 α7 n型乙酰膽堿能受體可以參與膽堿能抗炎通路的激活，進而在多種病理狀態下發揮抗炎作用[5]。目前研究已表明，α7 n 型乙酰膽堿能受體介導的膽堿能抗炎通路在多種疾病的發生發展中發揮抑制作用[6]。

與其他巨噬細胞一樣，小膠質細胞也分為經典活化的M1 型巨噬細胞和選擇性活化的M2 型巨噬細胞[7]。一般來講，M1 型巨噬細胞主要分泌促炎因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18 等；而M2 型巨噬細胞主要分泌抗炎因子，如IL-4、IL-10、IL-13 等[8]。因此，在炎癥免疫相關疾病中，降低M1/M2 細胞的比例成為重要的治療手段。

自噬是生物體的一種重要的代謝機制，利用溶酶體降解自身受損細胞器和大分子物質的進化上高度保守的過程[9]。自噬通常分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬，由于大自噬的研究相對較多，在疾病中的作用也較為突出，因此，本研究主要討論大自噬的作用（后續將描述為“自噬”）。在自噬過程中，自噬小體形成，包裹細胞組分或入侵的病原體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后自噬溶酶體將包裹的底物降解并釋放入胞漿供細胞重新利用[10]。已有報道，自噬具有抗炎的作用[11]。

由此，本課題組探究在小膠質細胞中，α7 n 型乙酰膽堿能受體是否具有抗炎的作用，并且探究這一過程是否有調節M1 型與M2 型巨噬細胞的比例與誘導自噬過程的參與。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑與儀器

75%乙醇、異丙醇、甲醇、吐溫-80、20×PBS、BSA、Tris 堿、多聚甲醛、引物、LPS、DMEM 高糖培養基、抗LC3 抗體、抗Beclin-1 抗體、抗p62/SQSTM1 抗體、熒光二抗、DAPI 染料、氯仿、細胞/組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑（三聯裝）、甘氨酸、30%聚丙烯酰胺溶液、過硫酸銨、TEMED、1.5 mol/L Tris（pH 8.8）、1.5 mol/L Tris（pH 6.8）。JA2003 電子天平（上海天平儀器廠）；電熱恒溫水浴槽DK-8D（上海一恒科學儀器有限公司）；STS-8A 轉移脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司）；離心管（Corning 公司）；移液槍（Eppendorf 公司）；7500RT-PCR 儀器（Applied Biosystems 公司）；超純水儀（Millipore 公司）；熒光顯微鏡IX71（日本Olympus 公司）；錐形瓶；激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；酶標儀（瑞士Tacan 公司）；細胞操作超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）；Odyssey 掃膜儀（LI-COR 公司）。

1.2 主要方法

1.2.1 BV2 細胞的培養與處理

BV2 小膠質細胞系（美國ATCC 細胞庫）。細胞常規培養加入10% FBS 的DMEM 高糖培養基中，培養在37°C、5% CO2的培養箱中。在實驗中，我們提前10 min 加入PNU282987 孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細胞12 h。

1.2.2 實時定量PCR

提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，使用cDNA 進行實時定量PCR 檢測，引物由上海生工生物合成，序列見表1。

表1 實時定量PCR 引物序列

按規范程序設置PCR 儀，所得CT 值按照2–ΔΔCT公式計算。

1.2.3 Western blot

提取細胞/組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，經加樣、跑膠、轉膜等步驟后，PVDF 膜孵育牛奶封閉3 h，后分別孵育一抗（4 ℃過夜）、二抗（35 min，避光），用PBST 液進行漂洗后，置于Odyssey 掃膜儀中獲取Western blot 圖像。

1.2.4 細胞免疫熒光

取出經過處理后的BV2 細胞，棄掉培養基，加入PBS 液潤洗，用4%多聚甲醛室溫孵育固定10 min，用PBS 液洗滌5 min×3 次，后用0.1% Triton X-100 室溫孵育5 min，用PBS 洗滌5 min×3 次；用山羊血清封閉室溫10 min，后孵育一抗（室溫1 h）、二抗（37 ℃，30 min，避光），加入DAPI 染核3 min，后用PBS 洗滌5 min×3 次，加入抗熒光淬滅劑后于激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.5 統計學分析

2 結果

2.1 炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體具有抗炎作用

首先，我們探究在小膠質細胞中，α7 n 型乙酰膽堿能受體對炎癥反應水平的影響。提前10 min加入PNU282987（10 μmol/L）孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細胞，刺激12 h 后，通過實時定量PCR 技術檢測BV2 細胞的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（圖1）。

從圖1 中可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質細胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平顯著增加，而應用PNU282987 激動α7nAChR 極大地降低了促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA水平。由此可以看出，炎癥環境中激動α7nAChR在小膠質細胞中的抗炎作用。

圖1 激動 α7 n 型乙酰膽堿能受體抑制BV2 細胞的促炎因子表達 (n=3～5)

2.2 炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體調節小膠質細胞M1 型與M2 型比例

炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體在小膠質細胞中的抗炎機制。提前10 min 加入PNU282987（10 μmol/L）孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細胞，刺激12 h 后，通過實時定量PCR技術檢測BV2 細胞的M1 型巨噬細胞標記物CD68、CD86 與M2 型巨噬細胞標記物CD206、Arg1 的mRNA 水平（圖2）。

從圖2 可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質細胞中M1 型巨噬細胞標記物CD68、CD86 的mRNA 水平顯著增加，而應用PNU282987 激動α7 n型乙酰膽堿能受體極大地降低了巨噬細胞標記物CD68、CD86 的mRNA 水平并增加了M2 型巨噬細胞標記物CD206、Arg1 的mRNA 水平。

圖2 激動α7 n 型乙酰膽堿能受體對BV2 細胞M1 型與M2 型巨噬細胞標記物的mRNA 水平影響 (n=3～5)

對BV2 細胞進行同樣的處理，而后通過細胞免疫熒光技術檢測M1 型巨噬細胞比例（CD45+、CD68+細胞，圖3）與M2 型巨噬細胞比例（CD45+、CD206+細胞，圖4）。

從圖3 和圖4 可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質細胞中M1 型巨噬細胞比例顯著增加，而應用PNU282987 激動α7 n 型乙酰膽堿能受體極大地降低了M1 型巨噬細胞的比例并增加了M2 型巨噬細胞的比例。

圖3 激動α7 n 型乙酰膽堿能受體對M1 型小膠質細胞比例的影響

圖4 激動α7 n 型乙酰膽堿能受體對M2 型小膠質細胞比例的影響

綜合圖2～4 的結果可以發現，炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體可以調節小膠質細胞M1 型與M2 型比例，增加M2 型巨噬細胞的比例并降低M1 型巨噬細胞的比例。

2.3 炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體上調小膠質細胞自噬水平

最后，我們探究炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體的抗炎作用是否有自噬過程的參與。選用不同劑量的PNU282987，提前10 min 加入PNU282987（0.1、1、10 μmol/L）孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細胞，刺激12 h 后，通過Western blot 技術檢測BV2 細胞中的自噬相關蛋白Beclin 1、LC3-II/I 比例、p62/SQSTM1 表達水平（圖5）。

圖5 激動α7nAChR 上調BV2 細胞自噬水平 (n=3)

從圖5 中可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質細胞中自噬水平顯著增加，而應用PNU282987 激動α7 n 型乙酰膽堿能受體進一步增加了自噬水平。由此可以看出，炎癥環境中激動α7 n 型乙酰膽堿能受體可以上調BV2 細胞的自噬水平。

3 討論

α7 n 型乙酰膽堿能受體介導的膽堿能抗炎通路在多種炎癥免疫相關疾病中發揮重要的調節作用。課題組的前期研究發現，在小鼠多發性硬化模型中，激動α7 n 型乙酰膽堿能受體可以發揮重要的抑制小膠質細胞炎癥的作用[12]。本研究在細胞水平應用小膠質細胞系BV2 細胞，再次證明了α7 n 型乙酰膽堿能受體的抗小膠質細胞炎癥的作用。

對于在小膠質細胞中α7 n 型乙酰膽堿能受體抗炎作用的機制，本研究首次表明，其抗炎作用的實現有調節小膠質細胞M1 型和M2 型巨噬細胞比例的參與，即激動α7 n 型乙酰膽堿能受體可以上調具有抗炎作用的M2 型巨噬細胞并且下調M1型巨噬細胞的比例。這一結論為利用α7 n 型乙酰膽堿能受體激動劑作用治療相關疾病的藥物提供了重要的理論依據。此外，我們也探討了自噬這一重要的抗炎機制是否參與了這一過程。通過細胞實驗得到了肯定的答案，與以往研究相一致，我們證明了上調小膠質細胞的自噬水平發揮抗炎作用。

由此我們得出，激動α7 n 型乙酰膽堿能受體可以發揮抑制小膠質細胞炎癥反應的作用，其作用的實現依賴于調節小膠質細胞M1 型和M2 型巨噬細胞比例和上調自噬水平。下一步，我們將通過單核巨噬細胞特異性敲除α7 n 型乙酰膽堿能受體的小鼠進行研究，進一步驗證激動α7 n 型乙酰膽堿能受體是否可以通過調節巨噬細胞比例和自噬水平，進而抑制小膠質細胞炎癥發揮作用，使實驗結果更具說服力。我們相信，這一研究將為開發利用新的膽堿能抗炎藥物提供新的思路。