活性多肽GRGDS 對氧糖剝奪誘導PC12 細胞損傷的保護作用及其機制研究

張 城，馬劍平，沈育樺，朱文君，劉河龍，邱 彥 （上海健康醫學院附屬浦東新區人民醫院藥劑科，上海 201200）

腦卒中是人類疾病中最常見的腦血管疾病，已經成為人類死亡的第二大原因[1]。腦卒中引起的一系列并發癥和后遺癥給患者家庭帶來了不可估量的負擔。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種，其中，缺血性腦卒中又稱腦中風，是腦卒中主要的發病方式，約占腦卒中患者的83%以上[2]。目前，尚無有效的治療藥物用于腦卒中引起的損傷，尤其是對于神經損傷的治療[3]。活性多肽GRGDS 是由甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS）5 種氨基酸構成，主要通過形成一個β 轉角的方式與其他細胞發生黏連[4]，因而，能夠阻斷細胞外基質和細胞表面整合素的結合和黏附，可應用于組織工程或者癌癥和腫瘤方面。本試驗采用PC12 細胞體外模擬腦缺血模型，探討活性多肽GRGDS 對氧糖剝奪損傷后的PC12 細胞是否具有保護作用。

1 材料

1.1 細胞株

PC12 細胞購自ATCC 細胞庫，培養在含有10%胎牛血清的完全培養液中，每12 h 觀察一次細胞的生長狀態，每24 h 更換一次細胞培養液，待細胞長到80%進行傳代。

1.2 藥物與試劑

活性多肽GRGDS（上海淘普生物科技有限公司）；高糖DMEM 培養液、DMEM 無糖培養液（Gibco 公司）；凋亡試劑盒、蛋白質提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；抗體：β-肌動蛋白（βactin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)、磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(P-SAPK/JNK)、Bax 蛋白（美國CST 公司）。

1.3 儀器

細胞培養箱、酶標儀（美國Thermo 公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；細胞缺氧裝置（美國Billips-Rothenberg 公司）；流式細胞儀（BDBiosci-ences 公司）；Western blot 圖像掃描儀（美國Odyssey 公司）。

2 方法

2.1 PC12 細胞氧糖剝奪損傷模型的建立

氧糖剝奪模型參照文獻[5]體外模擬腦缺血模型，即OGD 模型，再根據實驗過程中的實際情況稍作改造。將細胞培養在培養板中，待細胞生長至培養板底面積80%以上，將對照組的培養液換成無血清高糖完全培養液，OGD 組換成無糖培養液，活性多肽GRGDS 給藥組換成加有GRGDS 藥物處理的無糖培養液。將含有3 組細胞的培養板置于恒溫培養箱中孵育1 h，然后將模型組和給藥組的細胞置于缺氧裝置中，通入混合氣體（95%N2，5%CO2），使裝置內的氧氣完全排出，分別將細胞缺糖和缺氧2、4、6、8 h 后取出，采用MTT 法選出細胞損傷的最佳時間，進行后續試驗研究。

2.2 MTT 法測定細胞活力

將PC12 細胞以2.0×105個/ml 的密度鋪于96 孔板中，按照“2.1”項下方法進行操作，在缺糖、缺氧之前，將給藥組細胞的培養液換成含有不同濃度的活性多肽GRGDS（10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μg/ml）的無糖培養液置于培養箱中適應1 h，OGD 組和給藥組一同置于缺氧裝置中缺氧4 h。缺氧過后取出培養板，在避光條件下將所有組的細胞加入每孔20 μl 提前配好的0.5%MTT 溶液（5 mg/ml），用錫箔紙包好將其放入37 ℃恒溫培養箱中，繼續孵育4 h 后棄掉上清液，再向每個細胞培養孔中加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)溶液，溫室振蕩5 min，用全自動酶標儀在492 nm 波長處檢測每個孔中細胞的吸光值（A）。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將PC12 細胞鋪于6 孔板中，待細胞貼壁后將OGD 組中的培養液換成無糖DMEM 培養液，給藥組中的培養液換成加有活性多肽GRGDS 處理的無糖DMEM 培養液，恒溫孵育1 h 后置于缺氧裝置中缺氧4 h，缺糖、缺氧后棄掉每孔中的細胞上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2 次，洗掉細胞表面殘留的培養液，再用不含依地酸(EDTA)的胰蛋白酶消化液消化1～2 min。將各組細胞置于不同的離心管中，以1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，再加入PBS，將細胞進行重懸后再離心。離心后棄掉上清液，每個離心管中加入500 μl 的1×緩沖液輕輕吹打混勻，避光條件下向各離心管中加入5 μl 的細胞凋亡檢測試劑(annexin V-FITC)，室溫放置5 min 后，再加入5 μl 的碘化丙啶(PI)染色液。充分混勻后室溫避光放置15 min，用流式細胞儀進行檢測。

2.4 ELISA 檢測OGD 后PC12 細胞相關炎癥因子的變化

將PC12 細胞氧糖剝奪后取細胞上清液，4 ℃、300 r/min，離心15 min。離心后取上清液放入4 ℃冰箱冷藏保存，若不能及時檢測，應將上清液放在?20 ℃冷凍保存。按照試劑盒中的說明書建立標準曲線，檢測各組樣本吸光值，并計算其濃度。

2.5 Western blot 檢測相關蛋白的表達

將氧糖剝奪損傷后的各組細胞上清液棄掉，用預冷的PBS 清洗細胞表面殘留的培養液，用細胞刮刀將各組細胞刮掉，置于預冷的RIPA 裂解液中裂解30 min，使細胞中的蛋白完全裂解，以12 000 r/min，離心10 min，取上清液。BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。各組蛋白中加入20 μl 5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。10%SDS-PAGE 分離蛋白，轉膜，用含5%脫脂奶粉的Tris 緩沖液封閉1 h，孵育一抗4 ℃環境下過夜，回收一抗，洗膜3 次（5 min/次），室溫條件下加二抗，避光孵育2 h 后洗膜。使用Western blot 圖像掃描儀掃描并統計結果。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 活性多肽GRGDS 對OGD 損傷的PC12 細胞的保護作用

為了選擇合適的缺糖缺氧時間，本實驗設置了2、4、6、8 h 的時間點，結果顯示，細胞生存率隨著氧糖剝奪時間的增長而顯著降低，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01），且缺糖缺氧4 h 細胞明顯皺縮，細胞活性明顯降低，細胞的損傷率達到50%，此時的損傷率有利于藥物補救，更有助于細胞的恢復，因此，氧糖剝奪損傷時間為4 h 條件最佳（圖1A）。活性多肽GRGDS 給藥濃度為0.01 μg/ml，可顯著提高缺糖缺氧4 h 后PC12 細胞的活力（P<0.01）。因此，選擇缺糖缺氧4 h，給藥濃度0.01 μg/ml 作為實驗條件進行后續研究（圖1B）。

圖1 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞的影響（n=3）

3.2 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞的凋亡

將細胞以2.0×105個/ml 細胞密度鋪于6 孔板中，培養16 h 后，將OGD 組細胞的高糖培養液換成無糖的DMEM 培養液，給藥組細胞的高糖培養液換成給予活性多肽GRGDS 藥物處理的無糖DMEM 培養液，37 ℃恒溫培養箱中平衡1 h，缺氧4 h，而正常對照組細胞的培養液換成新的高糖DMEM 培養液繼續培養。缺糖缺氧結束后，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。圖2 結果顯示，與正常對照組比較，OGD 組細胞的凋亡率顯著增加（P<0.01），由正常對照組（2.26±0.61）%上升到（12.14±1.69）%。給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml劑量濃度處理后，細胞凋亡率明顯降低，凋亡率降至（6.94±1.45）%（P<0.01）。

圖2 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞凋亡率的影響（n=3）

3.3 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量

正常對照組細胞上清液中TNF-α 的含量為（27.16±2.69）pg/ml，兩者相比，OGD 組細胞中的TNF-α 含量明顯增加（P<0.01），為（54.51±2.89）pg/ml；與OGD 比較，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理的細胞上清液TNF-α 的含量顯著降低，為（38.32±18）pg/ml（P<0.01，圖3A）。正常對照組細胞上清液IL-1β 的含量為（15.4±0.11）pg/ml，OGD組細胞上清液中IL-1β 的含量為（35.99±2.25）pg/ml，兩者相比，OGD 中的IL-1β 含量顯著增加（P<0.01）。與OGD 比較，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理的細胞上清液中IL-1β 的含量顯著降低，為（21.84±1.18）pg/ml（P<0.01，圖3B）。

圖3 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的影響（n=3）

3.4 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達

本實驗檢測了MAPKs 信號通路中的JNK 信號通路中相關蛋白表達的影響。結果如圖4 所示，PC12 細胞經過氧糖剝奪損傷后，細胞中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達與正常對照組細胞相比均顯著升高（P<0.01）；而給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后，可明顯降低氧糖剝奪損傷后細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達（P<0.01）。

圖4 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達的影響（n=3）

3.5 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞中加入JNK 抑制劑p-JNK、Bax 蛋白的表達

將原始濃度為10 mmol/ml 的JNK 抑制劑（SP600125）稀釋成10 μmol/ml 的濃度加入到PC12細胞中，缺糖缺氧后提取細胞蛋白分別檢測p-JNK 及其下游Bax 蛋白的表達情況。結果如圖5所示，OGD 組細胞中p-JNK、Bax 的蛋白表達與正常對照組細胞相比都顯著增加（P<0.01）；給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度以及JNK 抑制劑處理后，p-JNK、Bax 蛋白的表達水平與OGD 組相比均明顯降低（P<0.01）。

圖5 活性多肽GRGDS 對OGD 的PC12 細胞加入JNK 抑制劑后p-JNK、Bax 蛋白表達的影響（n=3）

4 討論

缺血性腦卒中是由血管阻塞引起的腦血液循環障礙誘發的神經系統損傷，致死、致殘率較高，且病理機制十分復雜，目前醫學上仍缺乏行之有效的治療方法。在急性缺血的早期階段，細胞凋亡可能是對氧糖剝奪的一種自我保護反應，有助于維護重要細胞的生存。然而，在局部缺血的大部分期間，鈣超載、氧自由液和溶酶體酶的釋放均會導致細胞壞死[6]。

最新研究表明，活性多肽GRGDS 可激活體內干細胞，促進細胞的增長和分化[7]。但是，活性多肽GRGDS 對于PC12 細胞凋亡引起的一系列炎癥反應的作用尚未見研究報道。因此，本實驗研究了活性多肽GRGDS 對氧糖剝奪損傷的PC12 細胞凋亡和凋亡反應的抑制作用，并初步探討其可能存在的藥理和藥效機制。首先，建立氧糖剝奪損傷的PC12 細胞模型，同時加入不同給藥劑量濃度的活性多肽GRGDS 進行處理。結果發現，活性多肽GRGDS 的不同給藥劑量濃度可有效抑制氧糖剝奪PC12 細胞的損傷，并且當活性多肽GRGDS 的劑量濃度為0.01 μg/ml 時藥物作用效果最佳。故確定0.01 μg/ml 濃度作為機制探討劑量。

TNF-α 是一種促炎性多效細胞因子，研究表明，TNF-α 可以通過激活轉錄因子NF-κB 的機制阻止神經元的死亡或凋亡，從而誘導Mn-SOD 和Bcl-2 的表達[8]。TNF-α 在大腦發育過程中起著效應分子的作用，經常參與不同的信號通路，激活巨噬細胞和神經膠質細胞，促進神經毒素的產生，并啟動神經細胞的凋亡或死亡過程[9]。IL-1β 作為一種炎癥和免疫源性細胞因子，可在多個環節參與腦缺血損傷機制。研究表明，大量炎性細胞因子（IL-1β、TNF-α）參與腦缺血再灌注損傷后腦細胞的凋亡和壞死[10]。因此檢測了氧糖剝奪損傷的PC12 細胞上清液，結果顯示，氧糖剝奪損傷后PC12 細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 含量顯著增加，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后，上清液中的TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低。

本研究結果顯示，經過氧糖剝奪損傷后，PC12 細胞的凋亡率明顯增加，而給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后PC12 細胞的凋亡率顯著下降，這提示了活性多肽GRGDS 可能通過抑制PC12 的凋亡而發揮神經保護作用。為了進一步研究活性多肽GRGDS 是否通過抗凋亡作用發揮對PC12 細胞的保護作用，本實驗試著對凋亡信號通路中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 等相關蛋白的表達進行了檢測。據報道，caspase 3 是細胞凋亡中的關鍵部分，是其信號傳導的效應通路。caspase 3 可能通過線粒體、內質網和死亡受體三種途徑激活體內細胞中的死亡信號。缺血性腦卒中一般會引起體內線粒體細胞色素c 的釋放導致caspase 3 的表達、激活和裂解，從而促進細胞凋亡。在細胞死亡引起的凋亡過程中，cleaved caspase 3 的表達會增加[11]。研究發現，MAPK 可以參與調節多種信號通路誘導或減輕細胞凋亡，活化的JNK 會引起腦缺血應激反應的細胞凋亡，而JNK 抑制劑在腦缺血再灌注損傷后提供神經保護作用。Bcl-2 蛋白家族中的抗凋亡Bcl-2（Bcl-xL）和促凋亡Bax 蛋白之間的動態平衡在決定腦缺血期間的細胞命運中起關鍵作用。越來越多的證據表明，Bcl-2（Bcl-xL）/Bax 比率的增加抑制Bax 易位至線粒體并保護神經元免受細胞凋亡的損傷，而平衡向Bax 過量的轉變會引起缺血誘導的神經細胞凋亡。本研究結果顯示，氧糖剝奪損傷后PC12細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達水平顯著升高，綜合流式細胞儀檢測氧糖剝奪損傷后PC12 細胞凋亡的結果，表明活性多肽GRGDS可能通過抑制凋亡信號通路中的JNK/Bax 信號通路，進而抑制氧糖剝奪損傷的PC12 細胞凋亡反應，最終發揮神經保護作用。

本研究結果表明，活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml劑量濃度可以明顯抑制氧糖剝奪損傷的PC12 細胞凋亡，降低細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量，并通過調控JNK/Bax 信號通路蛋白的表達發揮神經保護作用。活性多肽GRGDS 可能在腦缺血中對PC12 細胞引起的損傷具有一定的神經保護作用。進一步的研究還需在動物模型上進行更深一層的體內藥效試驗解釋活性多肽GRGDS 對缺血性腦卒中的影響及其作用機制，為活性多肽GRGDS在臨床上用于缺血性腦卒中的藥物治療提供良好的藥理學基礎。