趕黃草中大環多酚類成分含量測定及其提取工藝

陳 嵐，江圣圭，史鵬杰，蔡舒心，董志穎，孫連娜 （. 空軍杭州特勤療養中心療養三區藥械科，浙江 杭州3000；. 上海中醫藥大學中藥學院，上海 003）

趕黃草（Penthori Chinensis Herba）在民間又名水澤蘭、水楊柳等，以其為原料制成的單味成方制劑肝蘇顆?，F收載于《中華人民共和國衛生部部頒標準中藥成方制劑十三冊》附錄[1]。趕黃草是苗族的傳統藥物，主產于四川古藺，具有清熱、利濕、解毒、活血、平肝、健脾等功效[2]，可用于酒精性、非酒精性脂肪肝，淤積性、酒精性及其他誘導因素引起的肝損傷的保護和治療[3-13]。趕黃草中化學成分類型眾多，以黃酮類、萜類、酚酸類為其主要活性成分[14]。其中，具有以黃酮苷連接沒食子?；Y構的大環多酚類化合物（圖1）喬松素-7-O-[4'', 6''-(S)-六羥基二苯甲?；鵠-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose，PHG）、喬松素-7-O-[3''-O-沒食子?；?4'', 6''-(S)-六羥基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[3''-O-galloyl-4",6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-Dglucose，PGHG）、喬松素二氫查耳酮-7-O-[3''-O-沒食子?；?4'', 6''-(S)-六羥基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[3''-O-galloyl-4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose or thonningianin A，THA）的肝保護及抗肝纖維化活性較強[15-17]，同時也具有較好的降糖活性[18]，有較高的開發價值，故本實驗建立HPLC 法同時測定該3 種化合物的含量，并通過正交試驗優選其提取工藝，為該類成分的進一步開發研究提供前期基礎。

1 儀器與試劑

1.1 藥材來源

從四川收集3 批趕黃草藥材（表1），藥材經課題組孫連娜副教授鑒定為虎耳草科植物扯根菜（Penthorum chinensePursh）的干燥地上部分。各批次藥材均留樣于上海中醫藥大學中藥資源與生物技術研究中心。

1.2 儀器與試劑

XS105DU 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；XS104 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；HDM-10000B 數顯電熱套（上海利聞科學儀器有限公司）；N-1 300 旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社）；Milli-Q 純水機（美國Millipore 公司）；1 200 型高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司）；Centrifuge 5810R 高速臺式冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

PHG 對照品（批號：20 181 117）、PGHG 對照品（批號：20 181 103）、THA 對照品（批號：20 181 103）均由本實驗室制備，且經HPLC 歸一化法檢測表明純度均在98%以上；水為超純水；甲酸（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher 公司）；乙醇、甲醇（分析純，上海泰坦科技股份有限公司 ）。

2 方法與結果

2.1 大環多酚類成分的含量測定

2.1.1 對照品儲備液的制備

精密稱定PHG、PGHG、THA 對照品，加80%甲醇分別制成對照品儲備液，質量濃度分別為0.610 4、0.604 4、0.485 2 mg/ml。

2.1.2 供試品溶液的制備

取趕黃草藥材粉末（過3 號篩）1 g，精密稱定后轉移至250 ml 錐形瓶中，精密移取并加入80%甲醇水溶液100 ml，稱重確定初始重量，回流提取1 h，放至常溫，加溶劑補至初始重量，搖勻，取樣，過膜，取續濾液作供試品溶液。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）；洗脫條件：梯度洗脫（0～20 min，32%→50%A，20～25 min，50%→90% A，25～30 min：90%→32% A）；其他參數：流速為1 ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μl。在此色譜條件下，供試品溶液（圖2）中PHG、PGHG、THA 與其他成分均達到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數以PHG 計不低于20 000。

圖2 標準品溶液（A-C）與藥材提取液（D）HPLC 圖

2.1.4 線性關系考察

取“2.1.1”項方法制備的混合對照品溶液，依次稀釋2、4、10、50、100 倍，分別按“2.1.3”項色譜條件進樣測定，以3 種成分的進樣濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，分別進行HPLC 檢測，線性擬合得回歸方程。PHG、PGHG、THA 的回歸方程分別為：Y=18 575.798X+5.091 9（r=0.999 9），Y=21 923.382X+29.293 3（r=0.999 9），Y=21 544.589X?13.093 6（r=0.999 9），線性范圍依次是6.10～610.40、6.04～604.40、4.85～485.20 μg/ml，以上表明3 種化合物線性關系良好。

2.1.5 精密度考察

取對照品溶液，按“2.1.3”項色譜條件進行HPLC 檢測，連續進樣分析6 次，記錄峰面積。結果顯示PHG 峰面積的RSD 為1.15%，PGHG 峰面積的RSD 為0.18%，THA 峰面積的RSD 為0.12%，表明所用儀器精密度良好。

2.1.6 重復性考察

取趕黃草藥材（S3，過3 號篩）6 份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，再分別按“2.1.3”項色譜條件進行HPLC 檢測，記錄峰面積，計算含量。結果顯示樣品中PHG 的平均含量為5.83 mg/g，RSD為1.03%；PGHG 平均含量為9.99 mg/g，RSD 為0.91%；THA 平均含量為1.31 mg/g，RSD 為0.50%，表明本方法重復性良好。

2.1.7 穩定性考察

取趕黃草藥材（S3，過3 號篩）1 份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，分別放置0、4、8、12、24 h后取樣，按“2.1.3”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示樣品中PHG、PGHG、THA 峰面積的RSD 分別為1.72%、2.44%和4.06%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.1.8 加樣回收率考察

取同一批趕黃草藥材（S3，過3 號篩）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按照藥材含有量1∶1 的比例，分別精密加入PHG、PGHG、THA 對照品，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項條件進行HPLC 分析，記錄峰面積，計算回收率。結果顯示PHG、PGHG、THA 加樣回收率分別為102.04%、100.90%、101.55%，對應的RSD 值分別為0.88%、0.82%、1.43%，表明該方法可靠。

2.1.9 趕黃草藥材的含量測定

取各批次趕黃草藥材（S1～S3，過3 號篩）各3 份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液后按“2.1.3”項條件進行HPLC 分析，記錄峰面積并計算含量（表2）。

表2 趕黃草中3 種化合物的含量（n=3）

2.2 提取工藝的優化

2.2.1 提取方法考察

取趕黃草藥材（S2）切成3～5 cm 小段，稱取50 g，加入60%乙醇溶液500 ml，分別采用浸漬法（浸漬24 h）、滲漉法（浸泡24 h 后以5 ml/min 的流速收集滲漉液）、回流法（加熱回流1 h）提取。結果表明，浸漬法平均總提取率為36.67%，滲漉法平均總提取率為36.82%，回流法平均總提取率為71.99%?？疾旖Y果為回流法提取效果最佳，因此選擇回流法作為提取方法。

2.2.2 正交試驗[19-21]

在確定提取方法為回流法的基礎上，取趕黃草藥材（S2），選擇常規回流提取中對提取效果影響較大的因素：溶媒濃度（A）、提取時間（B）、溶媒用量（C）、提取次數（D）作為影響因素，每個因素各取3 個水平，在平行操作條件下，設計L9（34）正交試驗（表3）。

表3 正交試驗因素水平表

以PHG、PGHG、THA 的總提取率作為考察指標得正交試驗結果（表4），根據極差大小可以看出各因素對趕黃草中大環多酚類成分的影響大小為A>B>D>C；進一步方差分析（表5）結果表明，溶媒濃度（A）對提取效果有顯著影響（P<0.05），而其他3 個因素無顯著影響（P>0.05）。因此，根據正交試驗得出的最佳組合為A3B1C3D2。

表4 正交試驗結果表

表 5 方差分析表

3 討論與結論

本實驗比較并優化了供試品溶液制備方法，并考察了不同型號色譜柱、不同檢測波長、不同流動相組成，在此基礎上建立了趕黃草中PHG、PGHG、THA 的HPLC 檢測方法，該法能使樣品中測定成分與其他成分達到有效分離，峰型好，可簡便快速分析樣品，檢測結果準確可靠。

在建立含量測定方法的基礎上進行提取工藝優化。從毒性大小、常用性角度選擇乙醇為溶媒，單因素實驗結果顯示回流法提取效果最佳，因此選擇乙醇熱回流法作為提取方法，對常規熱回流法影響較大的4 個因素進行3 個水平設置，建立L9（34）正交試驗組，以便考察不同參數設定值對趕黃草中大環多酚成分提取率的影響。通過極差及方差分析發現溶媒濃度（A）即乙醇濃度對提取率有顯著性影響，而其他3 個因素（B、C、D）均無顯著性影響。經正交試驗優選后的最佳提取工藝為A3B1C3D2，結合生產實際，從節約原料降低成本的角度，對無明顯影響的3 個因素進行適當調整，調整后的提取工藝為A3B2C1D2，即取趕黃草干藥材，切3～5cm小段，加入10 倍體積、濃度為80%的乙醇溶液，回流2 次，每次2 h。按照該工藝，取3 批藥材各5 kg，進行3 次放大驗證試驗，提取率均在90%以上，且RSD 值為3.73%，說明該工藝穩定可行，可為趕黃草中該類成分的進一步開發研究打下基礎。