尿素14C膠囊中55Fe分析方法研究

馬莉娜，宋麗娟，楊永剛，王亞東，馬 彥，戴雄新

(中國輻射防護研究院，山西 太原 030006)

幽門螺旋桿菌(Hp)是目前所知能在人體胃酸中生存的唯一微生物種類。Hp感染能引發多種胃病，在2017年世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單中Hp被列為一類致癌物。目前，14C尿素呼吸試驗是Hp感染檢測的有效方式。尿素14C膠囊的初始14C原料通過中子輻照高純氮化鋁(AlN)靶獲得[1-2]，為保證藥品的放射性純度，需分析AlN靶原料經輻照后可能產生的放射性雜質核素及其放射性活度?！睹绹幍洹穂3]《中國藥典》2015 年[4]均未給出詳細可行的尿素14C膠囊中放射性雜質核素的檢驗方法。因此，需建立實際可行的尿素14C膠囊中放射性雜質核素的檢驗方法，確保藥品質量。

高純AlN靶中Fe、Co元素的最高含量分別可達到1 500 ppm及600 ppm[5]。Fe、Co等雜質元素被中子活化生成55Fe、60Co等放射性核素，其母體54Fe和59Co熱中子吸收截面較大，55Fe(t1/2=2.74 a)和60Co(t1/2=52 711 a)半衰期長，因此，55Fe和60Co是最有可能引起14C標記尿素原料藥的放射性核純度超標的主要雜質核素。60Co為高能β-γ核素，較易通過γ能譜、液閃或Cerenkov計數測量來檢驗[6-7]，而55Fe是電子俘獲衰變核素，其發射的低能俄歇電子及X射線的探測效率低，易被屏蔽而難以檢測。對55Fe最靈敏的檢測手段是液閃計數，但其液閃能譜處于極低能區[8-11]，14C為純β放射性核素，最大能量為156 keV[12]，能譜處于較高能區，完全覆蓋活度很低的55Fe 能譜，因此檢測14C標記尿素樣品中低活度的55Fe需首先將高活度14C從樣品中完全分離，才能進行55Fe的液閃測量。本工作擬建立尿素14C膠囊中放射性雜質核素55Fe分析方法，并對方法進行驗證，以滿足尿素14C膠囊生產中的質控需求。

1 實驗

1.1 主要試劑和儀器

55Fe標準溶液比活度為59 kBq/g，美國國家標準技術研究所(NIST)；14C標準淬滅源、Hisafe閃爍液，美國Perkin Elmer；濃HCl、六水合三氯化鐵，市售分析純。

Hidex-300SL液體閃爍計數器(LSC)，芬蘭Hidex；X射線熒光光譜分析儀、Milli-Q Reference超純水機系統，美國默克；XS-205分析天平，分度值為0.1 mg，美國梅特勒。

1.2 膠囊樣品中55Fe的化學分離及測量流程

膠囊樣品中55Fe的化學分離及測量流程示于圖1。具體過程如下。

1) 將AGMP-1強堿性陰離子交換樹脂在高純水中浸泡1 h，將浸泡好的樹脂裝入2 mL樹脂柱中，加入5 mL 9 mol/L HCl平衡樹脂。

圖1 尿素14C膠囊中55Fe的放化分析流程Fig.1 Flow diagram of radioanalytical procedure for determination of 55Fe in urea 14C capsule

2) 取1粒膠囊樣品和2 mL高純水加入50 mL離心管中，60 ℃水浴加熱至膠囊溶解后加入5 mg穩定鐵示蹤劑和10 mL 12 mol/L HCl，混合均勻。

3) 將第2步所得膠囊溶解液通過樹脂柱，再用10 mL 9 mol/L HCl以1 mL/min的流速淋洗樹脂柱，之后用3 mL 0.1 mol/L HCl將鐵洗脫至50 mL離心管中。在離心管中加入10 mL 12 mol/L HCl，混合均勻，再次通過樹脂柱，樣品全部流出后，用10 mL 9 mol/L HCl以1 mL/min的流速淋洗樹脂柱，最后用3 mL 0.1 mol/L HCl將鐵洗脫至20 mL聚乙烯(PE)閃爍瓶中。在閃爍瓶中加入0.6 mL 15 mol/L H3PO4、1 mL水和14 mL Hisafe閃爍液，避光放置12 h，采用LSC測量并計算55Fe的活度。

1.3 鐵標準工作曲線

稱取0.970 5 g分析純級六水合三氯化鐵于20 mL PE液閃瓶中，再加入0.1 mol/L HCl配置成10 mg/g的穩定鐵溶液。準確稱取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g濃度為10 mg/g的Fe3+溶液于系列20 mL PE閃爍瓶中，用0.1 mol/L HCl定量至3.000 0 g，混合均勻后，用X射線熒光光譜儀(XRF)測量其濃度，繪制鐵的標準曲線。

圖2 XRF測量的Fe3+標準曲線Fig.2 Standard curve of Fe3+ by XRF

1.4 14C活度測量

1) 尿素14C膠囊中14C活度測量

取1粒膠囊樣品，轉移至50 mL離心管中，加入2 mL高純水，60 ℃水浴加熱至膠囊溶解，取出0.2 g，轉移至20 mL聚乙烯閃爍瓶中，加入1 mL高純水和14 mL Hisafe閃爍液，混合均勻，采用LSC測量并計算膠囊中的14C活度。

2) 純化后樣品中14C活度測量

在純化后的洗脫液中加入14 mL Hisafe閃爍液，混合均勻，避光放置12 h后，采用LSC測量并計算樣品中14C的活度。

1.5 14C及55Fe液閃測量效率校正

1)14C液閃測量效率校準

取系列14C標準淬滅源，用LSC測量計數，測量時間為5 min。由式(1)計算每個淬滅源的14C測量效率ε14C。

(1)

其中：Am為14C淬滅源的活度測量值，Bq；Ae為14C淬滅源的活度理論值，Bq；Di為14C樣品兩管符合計數；D0為空白兩管符合計數；t為測量時間，s；

樣品的三管、兩管符合計數比(TDCR)計算公式如下：

(2)

其中：Ti為樣品三管符合計數；T0為空白三管符合計數。

14C的測量效率與TDCR的關系曲線如圖3所示，分析窗口為5～650道。

圖3 14C的TDCR-LSC效率校正曲線Fig.3 TDCR-LSC efficiency correction curve of 14C

2)55Fe液閃測量效率校準曲線

LSC測量55Fe時選擇的分析窗口為20～250道，淬滅校正曲線表達式如式(3)[8]所示。

ε55Fe=1.53TDCR0.91

(3)

1.6 流程驗證

在尿素14C膠囊樣品中，加入已知活度的標準55Fe，按照1.2節所述流程分離后，測量膠囊樣品中55Fe的活度，驗證流程的準確性。

2 方法的建立與驗證

2.1 方法建立

55Fe的分離純化可采用陰離子交換樹脂、TRU樹脂、溶劑萃取等手段[8,13]。陰離子交換樹脂對鐵有良好的選擇性以及較高的吸附容量，鐵離子與9 mol/L HCl生成陰離子絡合物吸附在陰離子樹脂柱上[8-9]，而碳不會吸附在陰離子樹脂柱上，可用適當的淋洗劑將其從樹脂柱上洗脫，從而達到分離純化的目的。測量尿素14C膠囊樣品中的55Fe時需將14C完全去除，膠囊中14C活度在μCi級，遠高于55Fe的活度，此外，55Fe淋洗液中含有高活度14C，不能直接排放，需在淋洗過程中考慮將淋洗液最小化，以方便放射性廢物的后續處理。已報道的文獻中，55Fe純化時，每個樣品淋洗液的體積超過60 mL[8-9]，會生成大量放射性廢液，因此需對方法進行改進。

將樣品按1.2節溶解并調節酸度后，通過2 mL AGMP-1樹脂柱，再用10 mL 9 mol/L HCl淋洗14C、0.1 mol/LHCl洗脫55Fe后測量，樣品中14C殘余量可達到30 Bq，會顯著干擾55Fe的測量。將洗脫后的樣品用12 mol/L HCl調至9 mol/L，再次通過2 mL AGMP-1樹脂柱，用10 mL 9 mol/L HCl淋洗，淋洗液的測量結果示于圖4。由圖4可知，14C低于檢測限(0.1 Bq)，其測量譜與空白樣品無差異。以上結果表明，采用AGMP-1樹脂柱2次純化可有效除去樣品中的高活度干擾核素14C，并將淋洗液的體積減小至20 mL，有利于放射性廢物的儲存與處理。

圖4 AGMP-1樹脂柱2次純化后的膠囊樣品與空白樣品的14C液閃測量譜Fig.4 Liquid scintillation spectra of 14C in capsule sample after purified twice by AGMP-1 resin column and blank sample

2.2 尿素14C膠囊中放射性雜質55Fe核純度限值估算

根據藥品制劑中<1 mg 的單個雜質按1%或5 μg(取最小值)的質控限度要求[14]，可限定其中任意一種放射性雜質核素所造成的輻射劑量(即待積有效劑量，CED)不高于尿素膠囊中14C 本身所致劑量的1%，即：

(4)

式中：CEDI為放射性雜質核素的待積有效劑量；CED14C為14C的待積有效劑量；DCFI為放射性雜質核素的劑量系數；DCF14C為14C的劑量系數；AI為膠囊樣品中放射性雜質核素的活度；A14C為膠囊樣品中14C的活度。據此，可推導出式(5)用以估算尿素14C膠囊的放射性核純度(RP14C)：

(5)

根據式(5)可限定尿素14C膠囊中放射性雜質核素的純度。根據AlN靶中雜質元素的含量、中子反應截面、輻照時間及冷卻時間估算，尿素14C膠囊中最主要的放射性雜質核素為55Fe和60Co。尿素14C膠囊中主要雜質的放射性核純度計算結果列于表1。由表1可看出，放射性核純度限值要求最高的雜質核素是60Co，假設所有的雜質都是食入劑量系數最大的60Co時，計算得到尿素14C膠囊制劑的放射性核純度要求為99.83%。本工作取99.9%作為尿素14C膠囊制劑的放射性核純度要求，相應地單個放射性雜質核素55Fe的限值要求為0.1%。

表1 尿素14C膠囊中14C及主要雜質核素的放射性核純度估算結果Table 1 Estimation result of radionuclide purity of main impurity nuclide in urea 14C capsule

2.3 55Fe分析方法驗證

尿素14C膠囊樣品中55Fe活度的測定屬于雜質核素的限量檢查。根據藥典2015年版[4]中“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”，雜質限度測定方法的驗證指標包括專屬性、檢測限和耐用性。

1) 專屬性

尿素膠囊中14C活度約為3.7×104Bq，遠高于膠囊樣品中可能存在的55Fe的放射性活度，是測量55Fe最主要的干擾核素，14C的去污效果是影響方法專屬性最主要的因素。本實驗測量4批次膠囊樣品中14C的初始活度，并根據式(6)計算流程對14C的去污因子(DF)。

(6)

式中：Q14C,0為初始樣品中14C的活度，Bq；Q14C為純化后樣品中14C的活度，Bq；QFe,0為初始樣品中加入的穩定鐵的質量，mg；QFe為純化后樣品中穩定鐵的質量，mg；RFe為鐵的回收率(RFe=QFe/QFe,0)。

14C及55Fe的檢測限(MDA)由式(7)[16]計算：

(7)

式中：k為包含因子，取值1.645(置信度為95%)；B為液閃測量時空白樣品的二管符合計數；f為用于液閃測量的樣品質量與放化分離得到的樣品質量的比值；ε為液閃計數器的測量效率。

4批次膠囊樣品中14C的初始活度、純化后活度及流程對14C的去污因子列于表2。由表2可見，純化后14C活度均低于MDA，去污因子均>3×105，可見本方法可高效分離樣品中的高活度干擾核素14C。因此，可認為本方法對尿素14C膠囊中55Fe的測量具有很強的專屬性。

表2 不同批次尿素14C膠囊樣品純化后14C去污因子Table 2 14C decontamination factor of different batches of urea 14C capsule after purification

2) 耐用性

樣品溶解、過柱、淋洗步驟中由于人為操作所造成的損失，均可由回收率進行校正，以確保方法的耐用性。流程開始時在尿素14C膠囊樣品中加入穩定鐵作為示蹤劑，流程結束后，用XRF測量接入PE閃爍瓶中樣品的穩定鐵含量，每個樣品測量3 min，計算樣品濃度及回收率，結果列于表2。由表2可見，鐵的回收率在57%～67%之間，回收率較低的樣品可能是由于樣品在多次上樣、轉移的過程中沾在容器壁上造成的損失。

3) 檢測限

根據2.2節，膠囊樣品中55Fe的放射性核純度限值低于0.1%，14C的活度約為3.7×104Bq，故膠囊中若能準確測得37 Bq的55Fe，即可說明本工作建立的分離測量流程完全適用于膠囊樣品中55Fe的測量。

在4個批次的尿素14C膠囊樣品中分別加入約30 Bq和3 Bq的55Fe放射性標準溶液，按1.2節所示流程分離后，測量樣品中55Fe的活度，結果列于表3，可見測量值與標稱值的相對偏差小于±10%。

表3 加標樣品的測量結果Table 3 Measurement result of spiked sample

膠囊樣品加標前后的液閃測量譜示于圖5。從圖5可看出，采用55Fe分析流程分離純化后的加標樣品，55Fe 的信號明顯可見，依據該譜圖即可判斷膠囊樣品中是否含有高于核純度限值的55Fe。

圖5 加入標準55Fe樣品與空白樣品的液閃測量譜Fig.5 Liquid scintillation spectra of spiked standard 55Fe sample and blank sample

3 實際膠囊樣品中55Fe的測量

按本文所建立流程測定上海某醫藥公司生產的4批次尿素14C膠囊的平行樣品，結果列于表4。從表4可知，4批次樣品均未檢測到高于55Fe 檢測限(0.4 Bq)的信號，滿足55Fe放射性核純度小于0.1%的質控要求。這主要是由于輻照后AlN靶需經過一系列化學轉化合成流程最終制備成14C標記的尿素，這些化學轉化及合成工藝對14C中的放射性核素雜質有極高效的分離效果。

表4 尿素14C膠囊樣品中55Fe的測量結果Table 4 Measurement resultof 55Fe in urea 14C capsule

4 結論

1) 本工作計算了尿素14C膠囊樣品雜質核素55Fe的限值，建立了尿素14C膠囊樣品中55Fe活度測定方法：膠囊樣品溶解后，采用AGMP-1陰離子交換樹脂對其進行2次分離純化，再用液體閃爍計數器測量55Fe的活度。

2) 驗證了方法的專屬性、耐用性和檢測限。

3) 實際尿素14C膠囊實測結果表明，本文所建方法滿足55Fe放射性核純度小于0.1%的質控要求。